神经纤毛蛋白1负调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路抑制肺成纤维细胞活化及其在小鼠肺纤维化中的作用研究
特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性、致死性间质性肺疾病，特征为成纤维细胞异常活化、细胞外基质（ECM）过度沉积和肺结构破坏，患者中位生存期仅3~5年［1-3］。目前临床获批药物（吡非尼酮和尼达尼布）仅能延缓肺功能下降，无法逆转纤维化进程，且存在肝肾毒性、胃肠道不良反应等局限性［4-7］。因此，探索IPF发病新机制及安全有效的治疗靶点至关重要。
神经纤毛蛋白1（Nrp1）是一种跨膜糖蛋白受体，早期研究集中在血管生成和轴突导向中的作用［8-10］。近年研究发现Nrp1具有促进肝、肾、心肌纤维化的作用［11］，但在肺纤维化（PF）中的作用尚未完全阐明。在放射性肺纤维化（RIPF）模型中，Nrp1通过促进M2型巨噬细胞极化和上皮-间质转化（EMT），加速纤维化进程［12］。佘炜等［13］研究表明，电离辐射后Nrp1表达升高，通过调控精氨酸酶1（Arg1）等M2型巨噬细胞标志物促进胶原沉积；使用拮抗剂EG00229可显著抑制纤维化。另有研究报道，Nrp1在IPF患者与PF动物模型肺组织中表达明显降低，并与肺功能损害［第1秒用力呼气量占预计值百分比（FEV1%pred）、用力肺活量占预计值百分比（FVC%pred）、一氧化碳弥散量占预计值百分比（DLCO%pred）下降］密切相关［14］。Zhang等［15］发现，肺组织2型固有淋巴样细胞（ILC2）特异性表达的Nrp1受转化生长因子β1（TGF-β1）诱导，通过增强白介素33/致瘤性抑制因子2（IL-33/ST2）信号通路促进纤维化。
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路是PF的核心驱动机制，通过促进成纤维细胞活化、EMT和炎症反应推动IPF进展。最新研究表明，过表达Nrp1通过激活PI3K/AKT通路，增强非小细胞肺癌对奥希替尼的耐药性［16］，Nrp1通过PI3K/AKT通路上调血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）表达，促进血管生成，加重肝硬化［17］，表明Nrp1对PI3K/AKT通路具有调控作用。基于此，本研究拟验证Nrp1在IPF患者及博来霉素（BLM）小鼠模型中的表达特征，探讨Nrp1是否通过PI3K/AKT通路直接调控肺成纤维细胞活化，评估外源性补充重组Nrp1蛋白能否改善纤维化进程及其安全性，为IPF的病理机制和疾病诊断研究提供新思路。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2022—2024年宁夏医科大学总医院呼吸与危重症医学科确诊的IPF患者45例，以及同期在本院健康管理中心体检的健康对照者29例。本研究方案已获宁夏医科大学伦理委员会批准（KYLL-2023-0516）。
IPF纳入标准：（1）根据最新的美国胸科协会/欧洲呼吸学会/日本呼吸学会/拉丁美洲胸科学会（ATS/ERS/JRS/ALAT）指南确诊为IPF［18］；（2）年龄>50岁；（3）排除其他已知原因的间质性肺疾病，如环境暴露（尘埃、霉菌）、药物毒性、自身免疫性疾病等；（4）患者能够进行语言或文字交流，有能力完成试验相关的辅助检查；（5）签署知情同意书：患者自愿参与研究，理解研究目的和流程。IPF排除标准：（1）其他类型的间质性肺疾病：如结缔组织病相关间质性肺病（CTD-ILD）、非特异性间质性肺炎、过敏性肺泡炎、结节病等；（2）合并严重的全身性疾病：如未控制的心血管疾病、肝肾功能衰竭；（3）妊娠或哺乳期女性；（4）无法配合检查或随访者。
健康对照者纳入标准：（1）无呼吸系统疾病或慢性肺部疾病史；（2）年龄和性别与IPF患者匹配；（3）自愿签署知情同意书并遵守研究程序。
1.2 实验动物与饲养
30只野生型C57BL/6J雄性小鼠（6~8周龄，体质量18~22 g）购自宁夏医科大学实验动物中心，饲养于SPF级动物房，温度（22±2）℃，湿度（50±10）%，12 h光照/黑暗循环，可自由摄食标准啮齿类饲料并饮用灭菌水。
1.3 实验细胞
小鼠肺成纤维细胞（MPFs）购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司，Nrp1过表达质粒构建、鉴定由上海吉凯生物技术有限公司完成。
1.4 试剂
BLM（IB0871）购自北京索莱宝科技有限公司；纤连蛋白Fibronection（Fn, ab2413）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA, ab5694）、波形蛋白Vimentin（Vim, ab24525）、Nrp1（ab81321）抗体购自Abcam公司；β肌动蛋白（β-actin，10494-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，60004-1-Ig）、PI3K（60225-1-Ig）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K，66444-1-Ig）、AKT（10176-2-AP）抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；磷酸化蛋白激酶B（p-AKT, T40116M）抗体购自Abmart公司；重组小鼠TGF-β1购自美国R&D Systems公司；重组小鼠Nrp1-Fc蛋白购自美国MCE公司；双辛酰亚胺酸（BCA）蛋白定量试剂盒（KGB2101-500）购自南京凯基生物科技发展有限公司；Nrp1酶联免疫吸附试剂盒（ELISA, JL54766）购自上海江莱生物科技有限公司。
1.5 实验方法
1.5.1 生物信息学分析
从基因表达数据库（GEO数据库）下载基因表达数据集GSE150910、GSE218997、GSE173523、GSE47460和GSE32537，使用R语言进行数据清洗、标准化处理、背景校正，并通过DESeq2包和limma包进行差异分析，最终进行数据可视化。
1.5.2 血浆cf RNA测序
使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集IPF患者和健康对照者空腹外周静脉血5 mL，4 ℃、3 000 r/min，离心半径15 cm，离心10 min，收集上层血浆，4 ℃、16 000×g离心10 min，去除血浆中细胞碎片，分装后保存于-80 ℃，送深圳市海普洛斯生物科技有限公司进行cf RNA测序。
1.5.3 TGF-β1刺激小鼠MPFs活化
TGF-β1刺激小鼠MPFs的活化实验采用第3~5代细胞。将MPFs消化后，按3×105个/孔接种于六孔板，培养24 h待细胞完全贴壁后，分为对照组和TGF-β1组，对照组使用完全培养基换液，TGF-β1组使用含有10 μg/L TGF-β1的完全培养基换液培养24 h［19］。
1.5.4 Nrp1过表达实验
实验分对照组、TGF-β1组、Nrp1过表达组和TGF-β1+Nrp1过表达组，每组重复3次。提前1 d接种细胞至六孔板，质粒转染前保证细胞汇合度在60%~80%。Nrp1过表达组和TGF-β1+Nrp1过表达组：更换新鲜完全培养基，将Nrp1过表达质粒6 μg与Advanced DNA转染试剂6 μL混合，混匀静置15 min后将混合物加入细胞。转染24 h后细胞换液。12 h后TGF-β1+Nrp1过表达组和TGF-β1组使用含10 ng/mL TGF-β1的完全培养基换液，对照组和Nrp1过表达组使用完全培养基换液。继续培养24 h后收集各组细胞，提取RNA和全蛋白。
1.5.5 构建重组蛋白Nrp1治疗小鼠PF模型
将30只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、BLM组、BLM+Nrp1组，每组10只。采用BLM气管滴注构建小鼠PF模型，对照组滴注等体积0.9%氯化钠溶液。建模后第2天，Nrp1组小鼠腹腔注射100 μg·kg-1·d-1的重组蛋白Nrp1，对照组和BLM组注射等体积0.9%氯化钠溶液，连续21 d后处死小鼠，收集肺组织、血浆和支气管肺泡灌洗液（BALF）［20］。本实验方案已获宁夏医科大学伦理委员会批准（IACUC-NYLAC-2023-252）。
1.5.6 HE染色
将对照组、BLM组和BLM+Nrp1组小鼠的肺组织切片脱蜡至水，苏木素染色，盐酸乙醇分化，返蓝液返蓝，伊红染色，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
1.5.7 Masson染色［21］
将对照组、BLM组和BLM+Nrp1组小鼠的肺组织切片脱蜡至水后，入重铬酸钾中浸泡过夜，自来水清洗；入铁苏木素A液及铁苏木素B液1∶1混合的染液浸染，自来水清洗；分化液分化，自来水清洗；入丽春红酸性品红浸染，自来水清洗；磷钼酸浸染；苯胺蓝染；1%醋酸分化；两缸无水乙醇脱水；二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜镜检，图像采集分析。
1.5.8 血浆肝肾功能指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）检测
采集对照组、BLM组和BLM+Nrp1组小鼠血液，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，离心半径5 cm，收集上层血浆，使用全自动生化仪检测血液生化指标，流程包括：仪器自检→准备试剂（平衡、录入）与样本（离心、检查）→自动加样反应→光学监测吸光度变化→计算结果→质控审核→生成报告。
1.5.9 免疫组织化学染色
将对照组、BLM组和BLM+Nrp1组小鼠的肺组织切片脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭后加入一抗Nrp1（1∶250）和α-SMA（1∶250）孵育过夜，次日加入二抗，使用DAB显色，复染细胞核，脱水封片，扫描仪分析。
1.5.10 Western blotting检测
小鼠肺组织和MPFs经RIPA裂解液裂解后，离心取上清即总蛋白。BCA法测定浓度后取20 μg蛋白质，经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭后，4 ℃孵育一抗。次日TBST洗膜3次，孵育相应二抗。滴加ECL发光液，蛋白成像系统曝光，Image J软件计算灰度值，分析小鼠肺组织和MPFs中Nrp1、α-SMA、Vim、Fn、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT表达水平。
1.5.11 qRT-PCR
使用Trizol和氯仿提取RNA，将RNA逆转录为cDNA。以GAPDH或β-actin为内参，以2-ΔΔCt法计算相对mRNA表达水平，引物由上海生工生物股份有限公司合成。
1.5.12 ELISA
参见说明书操作步骤，检测对照组、BLM组和BLM+Nrp1组小鼠血浆和BALF中Nrp1水平。
1.6 统计学方法
采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；非正态分布的计量资料采用M（P25，P75）表示，组间比较采用非参数检验；绘制血浆Nrp1诊断IPF的受试者工作特征（ROC）曲线。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 GEO公共数据集中Nrp1的表达及其与肺功能指标的相关性分析
分析数据集GSE150910，结果显示，IPF患者肺组织Nrp1基因表达水平低于正常肺组织，差异有统计学意义（P<0.05）。分析数据集GSE218997和GSE173523，结果显示，BLM诱导纤维化模型小鼠肺组织Nrp1基因表达水平低于正常肺组织，差异有统计学意义（P<0.05）。分析数据集GSE47460和GSE32537，结果显示，IPF患者BALF中Nrp1基因表达水平与DLCO%pred、FEV1%pred、FVC%pred呈正相关。
2.2 IPF患者与健康对照者临床基线资料比较
健康对照者中男18例、女11例，中位年龄63岁；IPF患者中男27例、女18例，中位年龄66岁。两者性别、年龄、BMI、肺总量（TLC）比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；IPF患者用力肺活量（FVC）、FVC%pred、肺总量占预计值百分比（TLC%pred）、DLCO%pred均低于健康对照者，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 IPF患者与健康对照者血浆中Nrp1的表达比较及其诊断效能
通过分析IPF患者与健康对照血浆中细胞游离RNA（cfRNA）的测序数据，以P<0.05和|log2FC|>1作为筛选标准，结果显示，IPF患者血浆中Nrp1的mRNA表达水平低于健康对照者，差异有统计学意义（P<0.05）。经ROC曲线分析，血浆中Nrp1诊断IPF的曲线下面积（AUC）为0.754（95%CI=0.634~0.874）。
2.4 过表达Nrp1对MPFs中活化相关分子表达的影响
Western blotting与qRT-PCR结果显示，4组α-SMA、Vim、Fn和Nrp1的蛋白和基因表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中相比于对照组，TGF-β1组α-SMA和Fn的蛋白和基因表达水平升高，Nrp1的蛋白和基因表达水平降低；相比于对照组，Nrp1过表达组α-SMA、Vim、Fn的蛋白和基因表达水平降低，Nrp1的蛋白和基因表达水平升高；相比于TGF-β1组，TGF-β1+Nrp1过表达组中α-SMA、Vim和Fn的基因和蛋白表达降低，Nrp1的蛋白和基因表达水平升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.5 过表达Nrp1对MPFs中PI3K/AKT通路的影响
为了探究Nrp1是否通过PI3K/AKT通路调控小鼠MPFs活化，采用Western blotting检测过表达Nrp1对PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白的影响，结果显示：4组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中相比于对照组，TGF-β1组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT升高；相比于对照组，Nrp1过表达组p-PI3K/PI3K降低；相比于TGF-β1组，TGF-β1+Nrp1过表达组中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.6 重组蛋白Nrp1对PF小鼠病理学形态的影响
HE染色显示：对照组小鼠肺组织结构完整，而BLM组肺泡结构破坏严重，伴炎性细胞浸润及肺泡壁增厚；重组Nrp1干预后，上述病理特征显著改善。Masson染色显示：BLM组小鼠肺泡结构融合伴大量胶原沉积，而Nrp1处理后胶原沉积减少，提示重组Nrp1可以改善PF病理特征，减少胶原沉积。
2.7 小鼠血浆ALT、AST、ALP、BUN和CREA水平
对照组、BLM组、BLM+Nrp1组小鼠血浆中 ALT、AST、ALP、BUN和CREA水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.8 重组蛋白Nrp1对PF小鼠肺组织中α-SMA、Vim和Fn表达的影响
免疫组化结果显示：BLM诱导后，小鼠肺组织中α-SMA增加，而注射重组蛋白Nrp1则降低α-SMA表达，表明Nrp1可有效抑制肌成纤维细胞活化。此外，相比于对照组，BLM组小鼠肺组织中可见少量Nrp1阳性表达，而经Nrp1治疗后Nrp1阳性表达升高。
Western blotting检测结果显示：对照组、BLM组、BLM+Nrp1组小鼠肺组织α-SMA、Vim、Fn、Nrp1蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中相比于对照组，BLM组小鼠肺组织中Nrp1蛋白表达水平下降，α-SMA、Vim和Fn蛋白表达水平升高；相比于BLM组，BLM+Nrp1组Fn表达水平降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.9 重组蛋白Nrp1对PF小鼠肺BALF、血浆Nrp1水平的影响
对照组、BLM组、BLM+Nrp1组小鼠BALF和血浆中Nrp1水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中相比于对照组，BLM组小鼠BALF和血浆中Nrp1水平均降低；相比于BLM组，BLM+Nrp1组小鼠BALF和血浆中Nrp1水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
本研究通过整合多组GEO数据集，发现IPF患者及BLM诱导的小鼠PF模型肺组织中，Nrp1基因表达均下调，与既往报道一致［14］。IPF患者BALF中，Nrp1表达与肺功能指标（DLCO%pred、FEV1%pred、FVC%pred）呈正相关，提示Nrp1可能通过调控肺组织修复与纤维化进程影响肺功能，其机制需结合细胞类型特异性进行深入解析。Nrp1在IPF及BLM模型中均低表达，反映了其在肺组织稳态维持中的保护作用。Zhang等［15］研究发现，肺组织中TGF-β1-Nrp1信号传导通过上调IL-33受体ST2表达，增强2型固有淋巴样细胞（ILC2）功能，加速纤维化；而在肺泡上皮细胞中，Nrp1缺失反而减轻EMT［22］。这种细胞类型依赖性功能分化解释了不同模型中的矛盾现象：放射性肺纤维化（RIPF）模型中，Nrp1通过增强Wnt/β-catenin和TGF-β1/Smads信号促进EMT［22］，而BLM/IPF模型以成纤维细胞活化为主导，Nrp1低表达削弱了其抗纤维化功能。Nrp1表达与DLCO%pred的强相关性具有重要临床意义。DLCO%pred反映肺泡-毛细血管膜气体交换效率，Nrp1作为血管生成调控因子，其低表达可能导致微血管密度降低，直接损害气体交换［23］。
通过高通量测序技术检测IPF患者血浆cfRNA表达谱，发现Nrp1 mRNA表达水平在IPF患者中下调，且其表达降低对IPF诊断具有一定鉴别能力（AUC=0.754）。该发现不仅为IPF的无创诊断提供了新的潜在生物标志物，也提示Nrp1可能参与IPF的病理生理调控网络，值得深入探讨其生物学意义及临床应用潜力。Nrp1作为Semaphorin 3A的受体，参与肺泡上皮细胞的迁移与损伤修复调控，其表达降低可能削弱上皮屏障的修复能力，导致反复微损伤持续存在，这正是IPF的始动因素［24］。IPF晚期常伴随肺血管系统破坏和异常血管生成。Nrp1作为血管内皮生长因子（VEGF）共受体，其下调可能干扰正常血管稳态，促进病理性血管重塑，加速纤维化进程［25］。血浆Nrp1 mRNA对IPF的诊断效能AUC=0.754，表明其具备中等鉴别能力。相较于传统临床指标如涎液化糖链抗原6（KL-6）（AUC约为0.85）或高分辨率CT（HRCT）视觉评分，单一Nrp1的诊断价值虽略低，但其优势在于血浆样本易于采集，可动态监测；基于PCR的检测技术便于临床推广。
肺成纤维细胞是肺纤维化中重要的效应细胞，其增殖和活化在纤维化进展过程中至关重要。TGF-β1是一种关键的促纤维化细胞因子，能够促进成纤维细胞活化，诱导其向肌成纤维细胞分化，促进ECM蛋白合成与沉积。体外实验通过对比TGF-β1刺激下对照组、TGF-β1组及TGF-β1+Nrp1过表达组的分子表达特征，发现Nrp1通过负向调控PI3K/AKT信号通路，抑制小鼠肺成纤维细胞活化及ECM异常沉积。具体而言，TGF-β1刺激导致Nrp1基因和蛋白表达同步下调，同时激活PI3K/AKT通路，并上调成纤维细胞活化核心标志物α-SMA、ECM的关键支架蛋白纤维连接蛋白Fn的表达；而Nrp1的过表达则能有效逆转上述过程，显著降低p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及成纤维细胞标志物水平。这一发现不仅深化了对纤维化疾病中ECM重塑机制的理解，也为靶向干预提供了新思路。
本研究通过腹腔注射重组Nrp1蛋白治疗PF小鼠，发现其能改善小鼠肺部病理特征，降低肺组织中肌成纤维细胞标志物α-SMA及Fn的表达，同时提升肺局部Nrp1水平。值得注意的是，治疗过程中血浆肝肾功能指标（ALT、AST、ALP、BUN、CREA）未见显著变化，而BALF中Nrp1水平升高，提示外源性Nrp1能有效递送至肺组织并发挥抗纤维化作用。结合TGF-β1刺激可显著下调MPFs内Nrp1表达，同时激活PI3K/AKT通路，诱导α-SMA和Fn合成，推测外源性Nrp1可能通过竞争性结合TGF-β1，进而阻断下游PI3K/AKT磷酸化。该研究为靶向Nrp1的肺纤维化治疗提供了新的干预思路，但其作用机制和临床应用潜力需结合多维度证据深入解析。
本研究也存在一定的局限性，首先样本规模小，缺乏人群分层：队列样本量相对有限，未根据IPF亚型（如稳定期与急性加重期）分层分析，可能掩盖Nrp1表达与特定临床表型的关联。其次缺乏诊断特异性验证：本研究未纳入其他间质性肺病（如CTD-ILD）作为对照，因此难以评估Nrp1对IPF的诊断特异性。
综上所述，本研究证实IPF患者肺组织、血浆及BALF中Nrp1表达降低，提示其可能作为IPF的潜在生物标志物。Nrp1通过负向调控PI3K/AKT信号通路，抑制肺成纤维细胞活化。此外腹腔注射重组Nrp1可以缓解小鼠肺纤维化，具有系统安全性。本研究的发现不仅深化了对IPF异质性机制的理解，也为开发靶向Nrp1的精准治疗策略提供了实验依据。肺纤维化的管理需要呼吸科、影像科、病理科、风湿免疫科（部分继发于结缔组织病）及全科医生的共同参与。Nrp1作为新的生物标志物和治疗靶点，为多学科讨论（MDT）提供了新的内容和依据。理解Nrp1相关研究的价值，有助于全科医生快速整合专科治疗意见、康复计划、长期随访监测（如定期检测血浆Nrp1趋势）和症状管理，确保肺纤维化患者获得连续、整合的照护。
参考文献略
