[共享]鼻咽癌的免疫治疗和基因治疗

鼻咽癌的免疫治疗和基因治疗
低分化鼻咽癌容易发生淋巴结和血道转移，导致治疗失败。人们寄希望于免疫学和分子生物学的发展能产生新型治疗策略。由于低分化鼻咽癌细胞几乎100％地感染Epstein-Barr病毒（EBV），为鼻咽癌的免疫治疗和基因治疗提供了契机。

1. 以EBV为靶点的鼻咽癌免疫治疗

1.1.鼻咽癌免疫治疗的理论基础

抗肿瘤免疫主要依赖于特异性细胞免疫。为逃避免疫监视，肿瘤细胞发展出多种免疫逃逸机制，包括：（一）改变肿瘤细胞的抗原递呈能力，如表达弱免疫原性的自身抗原、下调表达HLA I类分子、抗原相关转运蛋白（TAP）和免疫共刺激分子。(二) 诱导免疫抑制微环境，如肿瘤细胞表达TGF-β、IL-10和VEGF。（三）抑制细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性和诱导CTL凋亡。

中国人鼻咽癌（NPC）具备免疫治疗的基本要素。首先，肿瘤细胞几乎100％地感染EB病毒，病毒蛋白有较强的免疫原性，是理想的肿瘤抗原。其次，NPC细胞表达正常水平的HLA I类分子、免疫共刺激分子和TAP，抗原递呈机制正常。在体外NPC细胞能被HLA限制性CTL识别和裂解。第三，尽管EBV诱导多种细胞因子表达，鼻咽癌微环境对CTL活性无明显抑制作用。上述特点提示鼻咽癌是一种适合于免疫治疗的肿瘤[1] [2]。

1.2. 机体对EBV感染的免疫反应特点

感染EBV后机体产生多种抗体，业已证明，体液免疫的作用在于预防新的病毒感染，控制EBV潜伏感染依赖于细胞免疫，主要是CD4＋和CD8＋T细胞免疫。目前已鉴定多种HLA I等位基因限制的CTL表位（表40-1）[3]。EBV蛋白的CTL表位呈现下列特点：1. CTL表位选择通常是等位基因特异的（allele-specific），即一个CTL表位由一个HLA等位基因递呈。但个别情况例外，如HLA B27.02 /.04/.05均递呈EBNA3C 256-266。如果一个HLA等位基因递呈多个CTL表位，则其中一个为免疫优势表位（Immunodominant epitope），如HLA B8递呈EBNA3A 325－333和EBNA3A 158-166, EBNA3A 325－333是免疫优势表位。又如HLA A11递呈EBNA3B 416－424和EBNA3B399－408，EBNA3B 416－424是免疫优势表位。2. 大部分EBNA3A/3B/3C的CTL表位受EBV 1/2型别限制，而LMP2的CTL表位不受此限制。3. 50%以上的感染者能检测到EBV特异性CTL，以EBNA3家族特异性CTL为主。Lee[4] 报告在21例中国人外周血中14例存在EBNA3家族特异性CTL，11例存在LMP2特异性CTL，1例存在EBNA2特异性CTL，没有发现LMP1和BARF0特异性CTL。

表 20－4 EBV蛋白的CTL表位

鼻咽癌发生于抗病毒免疫的监视之下，表明感染鼻咽癌细胞的EBV已发生免疫逃逸。EBV逃避机体抗病毒免疫的机制尚不清楚，可能与下列因素有关：1. 下调病毒抗原表达：在鼻咽癌细胞中EBV表现为II型潜伏感染。EBV潜伏感染时免疫优势表位位于EBNA3家族，但II潜伏感染不表达EBNA3家族蛋白，主要表达LMP1和LMP2蛋白。2. 抗原变异：在华南地区LMP1和LMP2基因均存在DNA序列变异导致病毒蛋白的CTL表位丢失。华南地区流行30碱基缺失的变异型LMP1基因（del-LMP1）。在del-LMP1基因中，羧基段氨酸替换导致del-LMP1 丢失一个HLA A2等位基因限制的CTL表位[5][6]。动物实验也表明，del－LMP1的免疫原性明显低于原型（B95.8型）。同样，氨基酸替换导致华南地区来源的LMP2基因有4个CTL表位发生变化，其意义有待研究[7]。另外，RK-BARF0通过mRNA 多形性剪切而丢失CTL表位。3.抗原递呈障碍：LMP1和LMP2抗原经抗原相关转运蛋白（TAP）非依赖途径递呈，但TAP表达能抑制TAP非依赖途径的抗原递呈，有可能使LMP1和LMP2抗原递呈障碍。4.EBV诱导免疫抑制微环境：不仅EBV的BCRF1基因编码IL-10同源物（vIL-10），而且EBV诱导宿主细胞表达其它免疫抑制分子，如VEGF、EBI3等[8]。vIL-10的结构和功能均与人IL-10类似，能抑制免疫刺激性细胞因子产生、抑制树突状细胞成熟、影响TAP表达、抑制IL-2和IFN-γ活性和促进B细胞生长和转化。EBI3是IL-12亚单位p40类似物，能与IL-12的另一亚单位p35结合形成EBI3-p35复合物，从而拮抗IL-12。VEGF能抑制树突状细胞成熟。

1.3 鼻咽癌免疫治疗方案的设计原则

按免疫方式，免疫治疗分为主动性免疫和过继性免疫。按免疫反应的性质，免疫治疗分为非特异性免疫和特异性免疫。与肿瘤有关的免疫治疗包括主动特异性免疫以及过继性特异性和非特异性免疫。主动特异性免疫指通过激发机体特异性免疫机制来杀伤肿瘤细胞，如肿瘤细胞疫苗、树突状细胞疫苗等。过继性免疫指通过补充免疫效应细胞和抗体来杀伤肿瘤细胞，如细胞毒性T细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）、单克隆抗体等。

一般认为，肿瘤细胞的免疫原性表现异质性，不同细胞亚群的免疫原性有明显差异。例如，部分肿瘤细胞不表达HLA I类分子，部分肿瘤细胞高表达Her2、CEA等肿瘤相关抗原。设计免疫肿瘤策略时应参考肿瘤的免疫学特性。设计免疫治疗时，下列问题值得注意。一、治疗时机：免疫细胞以0级动力学形式杀伤肿瘤细胞。从理论上讲，免疫系统能清除的肿瘤细胞不超过 3.5×109个肿瘤细胞（相当于直径1.5cm的肿瘤），因此，免疫治疗的最佳适应症是经常规治疗后遗留的微小病灶[9]。二、免疫治疗方案的安排：当手术、放疗、化疗使肿瘤负荷降到最低时（CR），机体内可能存在多达109肿瘤细胞，与原发灶相比，这些肿瘤细胞的生物学特性已发生变化，主要为多数细胞处于休眠期，抗凋亡能力增强，HLA I类分子表达下调。由于微小病灶对化疗不敏感，是日后肿瘤复发的根源。从另一方面讲，在微小病灶中，只有部分肿瘤细胞表达HLA I类分子。肿瘤细胞肿瘤表达HLA I类分子是特异性细胞免疫的作用基础，但HLA I类分子又抑制NK细胞活性，因此，在设计免疫治疗计划时，应先使用特异性细胞免疫杀伤表达HLA 分子的肿瘤细胞，继而使用非特异性细胞免疫（如CIK细胞）杀伤不表达HLA 分子的肿瘤细胞[10]。

1.3.1 LMP2致敏的树突状细胞疫苗

树突状细胞（DC）是功能最强的职业抗原递呈细胞。DC摄取并加工抗原，使抗原肽与MHC分子形成复合体，递呈于细胞表面，从而激活CD4＋和CD8＋T细胞。DC不仅激活记忆T细胞，而且能致敏原初T细胞，使DC疫苗具备打破免疫耐受的可能性。肿瘤细胞表达细胞因子使DC不能进入肿瘤组织或不能加工、递呈肿瘤抗原。目前采取在体外荷载抗原DC的策略，使其恢复抗原递呈功能。完整的肿瘤细胞、细胞裂解物、细胞成分、完整蛋白质、CTL表位短肽、肿瘤细胞RNA等均能用于荷载DC细胞。I/II期临床试验表明，DC疫苗的毒副作用轻微，对淋巴瘤、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌等肿瘤有一定疗效。鼻咽癌组织微小，不宜直接作为肿瘤抗原。另外，鼻咽癌缺乏高频突变的癌基因和抑癌基因，在已知的肿瘤相关抗原中，约50％的鼻咽癌组织存在Her2蛋白过表达，Her2蛋白是一个潜在的靶点。所幸的是低分化鼻咽癌细胞表达LMP1和LMP2蛋白等病毒蛋白。病毒蛋白是外源蛋白，免疫原性较强。Del-LMP1蛋白的免疫原性低，并且存在潜在的致癌性，而LMP2基因序列相对保守，包含多个中国人鼻咽癌病人高频HLA等位基因限制的CTL表位,目前的研究集中于LMP2蛋白。LMP2抗原肽荷载的DC疫苗正在香港进行临床试验[11]。

有效激发T细胞受体（TCR）和辅助性T 1（Th1）极化是决定抗病毒免疫和抗肿瘤免疫效率的关键因素。T细胞借助其表面的TCR识别抗原肽－MHC分子复合物。大多数TCR是由α链和β链组成的异二聚体，α、β链均参与结合外源肽和自身MHC分子。改变抗原肽序列中个别氨基酸残基可能增加MHC－抗原肽复合物的稳定性或增加MHC－抗原肽复合物和TCR的亲和力。例如，Micheletti[12]报告将HLA-A *0201 限制的CLGGLLTMV(CLG)替换为CLAGLLTMV（3A） 和YLAGLLTMV（1Y-3A）后，3A和1Y-3A激发特异性CTL的能力强于CLG。

前CTL细胞向CTL细胞发育除需要抗原信号外，还需要辅助性T细胞表达的细胞因子。辅助性T细胞包括多个亚群，称为Th1、Th2、Th3和Th0细胞。Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ和LT等细胞因子，主要介导迟发性超敏反应（DTH）和巨噬细胞活化等细胞免疫反应。在一定条件下，Th1细胞还可刺激B淋巴细胞产生具有调理作用和补体固定功能的抗体，Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等细胞因子，主要促进B细胞增殖并分化成浆细胞，介导体液免疫和I型超敏反应。Th1细胞因子促进CTL发育，但Th2细胞因子是抑制还是促进CTl发育尚不清楚。一般在负载HLA I类抗原时附加能非特异地激发CD4+T细胞的抗原，如匙孔血蓝蛋白（KLH）等，帮助Th1极化[13]。

一般来讲，HLA I类分子与内源性抗原结合，递呈抗原到CD8＋T细胞，HLA II类分子与外源性抗原肽结合，递呈到CD4＋T细胞。通过交叉递呈机制，外源性抗原也可经HLA I类分子递呈，但效率低下。转染抗原基因到DC是提高抗原递呈效率的常用策略之一。Ranieri[14]报告腺病毒介导LMP2基因转染DC后能有效地激发抗病毒免疫反应。
3.2 EBV特异性、多克隆CTL过继性免疫治疗

正常人外周血存在EBV特异性多克隆CTL前体细胞，主要是针对EBNA3家族蛋白和裂解期蛋白的CTL细胞。免疫抑制人群出现移植后淋巴增生性疾病（Post-transplant lymphoproliferative disorder，PTLD），临床表现类似于传染性单核细胞增多症或出现发热、肝、肺、骨髓、小肠等多处淋巴组织增生。受累组织出现浆细胞增生、B淋巴细胞增生和B淋巴细胞瘤等多种病理改变。应用EBV特异性、多克隆CTL能有效地防治PTLD，其靶点主要是EBNA3家族蛋白。

一般认为在鼻咽癌组织中EBV表现为II型缺乏感染，不表达EBNA3家族蛋白。近来不断有证据提示在鼻咽癌组织中部分EBV可能进入流产性复制和裂解性感染，为使用EBV特异性多克隆CTL治疗鼻咽癌提供了理论依据。Chua[15]等在4例晚期鼻咽癌病人分别输注5×107～3×108自体EBV特异性CTL后，尽管没有观察到肿瘤变化，但病人外周血EBV特异性CTL前体数量增加，血浆游离EBV拷贝数下降。

1.3.3 γδT细胞过继性免疫治疗

T细胞依据TCR的组成分为αβT细胞和γδT细胞。γδT细胞包括上皮性γδT细胞和全身性γδT细胞。全身性γδT细胞主要分布于外周血中，具有高度多样性，人类全身性γδT细胞的TCRγδ主要是Vγ9/Vδ2基因。Vγ9/Vδ2T细胞对多种肿瘤细胞系有杀伤作用。Zheng[16]报告人γδT细胞能一过性抑制鼻咽癌CNE－2 移植瘤生长。

2. 鼻咽癌的基因治疗

2.1 放射增敏基因治疗

鼻咽癌对放疗高度敏感，但部分复发的肿瘤细胞呈现放射抵抗性。DNA受损后P53基因是启动细胞凋亡的关键基因。鼻咽癌细胞几乎不存在p53基因突变，但约70％的鼻咽癌组织表现 P53蛋白集聚，30％左右的肿瘤组织中P53蛋白丧失功能。Li[17]等将腺病毒介导的野生型p53基因转入鼻咽癌细胞系CNE-1和CNE-2Z,在体外观察到野生型p53基因使鼻咽癌细胞对放疗敏感性提高10倍。在裸鼠移植瘤模型，瘤内注射腺病毒介导的野生型P53基因后并没有观察到p53基因的放射增敏效应，可能与瘤内注射腺病毒后细胞转染率太低（<15％）有关。此外，顺铂是鼻咽癌常用辅助化疗药物，腺病毒介导p53基因使C666－1细胞系对顺铂增敏25％[18]。

2.2 靶向基因治疗

2.2.1 EBNA1诱导的靶向基因治疗

基因治疗的难点之一是靶向转染和靶向转录。EBV只感染鼻咽癌细胞而不感染正常鼻咽上皮细胞，使靶向基因治疗有可能通过EBV而实现。EBNA1是唯一在潜伏感染和裂解性感染时均表达的病毒核蛋白质。EBNA1 mRNA由W、Y、U和K外显子组成，编码区位于K外显子。EBNA1可分别由Cp、Wp、Qp和Fp启动，产生不同的转录产物。B95.8－EBNA1编码641个氨基酸，分为氨基端、甘氨酸－丙氨酸重复区和羧基端。不同病毒株的甘氨酸－丙氨酸重复数目有差异，导致EBNA1蛋白质分子量波动于65kD～72kD。EBNA1的大部分重要功能区位于羧基端。EBNA1蛋白质的生理作用是维持潜伏感染时EBV拷贝数的稳定。宿主细胞分裂时，EBNA1一方面与EBV基因组的潜伏复制起始位点结合，启动EBV基因组复制一次，另一方面EBNA1结合于宿主染色体，使EBV基因组分配到子代细胞中，最终子代细胞中EBV拷贝数不变。

EBV基因组中存在3个EBNA1结合位点，其中与EBNA1亲合力最强的是OriP中的FR序列。FR由20个30－bp重复序列组成，EBNA1与之结合后能启动其它EBV基因转录。Li等将OriP-FR序列构建于腺病毒载体，在携带EBV的鼻咽癌细胞系能特异地启动荧光素酶、β-半乳糖苷酶、p53、HSV-tk（单纯疱疹病毒胸苷激酶）和CD（胞嘧啶脱氨酶）基因表达[19]。OriP-FR介导的报告基因表达强度在不同的细胞系有显著差异。在携带EBV的C666-1细胞系β-半乳糖苷酶基因表达比EBV阴性的细胞系CNE-2Z强350倍，却比EBV阴性的鼻咽成纤维细胞系KS1强1000倍。在体外OriP-FR介导的p53特异性表达使C666-1对放疗增敏48％。

2.1.2 LMP1蛋白诱导的靶向基因治疗

LMP1蛋白表达于35％～65％的鼻咽癌细胞中。借助NF-κB等信号通路LMP1启动多种细胞基因和病毒基因表达。HIV的长末端重复序列（LRT）存在2个NF-κB结合位点。Wu[20]等构建LRT启动的TK基因表达载体。稳定转染LMP1和TK基因的C33A细胞接种于裸鼠皮下2周后内注射GCV（gancyclovir，甘昔络韦），结果肿瘤明显缩小。

3. 肿瘤增殖性病毒

肿瘤增殖性病毒指能在肿瘤细胞内特异地增殖并导致肿瘤细胞死亡的野生型病毒或重组病毒，如野生型新城疫病毒、水泡口炎病毒、E1B基因缺陷的腺病毒、γ-34.5基因突变的单纯疱疹病毒等[21]。腺病毒E1B基因编码一个55 Kd的蛋白质，该病毒蛋白能使细胞P53蛋白失活，腺病毒随宿主细胞增殖而复制。删去E1B基因后，如果细胞p53基因功能正常，P53蛋白使感染腺病毒的细胞停止增殖，因而腺病毒也不能复制。如果细胞p53基因功能异常，感染腺病毒的细胞会继续增殖，腺病毒随之复制，导致细胞裂解，病毒释放，继续感染其它细胞。因此，E1B基因缺陷的腺病毒能特异地诱导p53功能异常的肿瘤细胞死亡。目前，E1B缺陷腺病毒治疗肿瘤已进入II/III期临床试验，尽管治疗反应与p53蛋白的功能的关系不明确，但瘤内注射E1B缺陷腺病毒与顺铂联合应用在治疗复发性头颈癌（不包括鼻咽癌）时收到较好的效果。如上所述，部分鼻咽癌细胞表现出 p53功能失活，使E1B缺陷腺病毒有可能应用于治疗鼻咽癌。

综上所述，鼻咽癌的免疫治疗和基因治疗均处于临床前或临床I期阶段，要将免疫治疗和基因治疗应用于鼻咽癌，还有很长的路要走。让我们共同期待着新时代的到来。