科研必备 | 质粒构建全流程与菌落 PCR 验证的标准操作指南！

一、质粒构建流程

  1、目的基因获取 在生物医学研究中，当已明确知晓目的基因的序列信息时，便可以依据此序列精心设计特异性引物，进而从基因组 DNA 或 cDNA 中高效扩增出目的基因。这一方法因其广泛的适用性以及相对简便的操作流程，在众多实验场景中备受青睐，为后续的质粒构建工作奠定了坚实基础。

（1）引物设计 引物的合理设计对于目的基因的精准扩增至关重要。通常情况下，引物的长度应控制在 18-25 个碱基之间，以确保其具有良好的结合特异性和稳定性。在设计过程中，需格外注意上下游引物的 Tm 值，力求使其相差不超过 5℃，从而保证在 PCR 反应中，引物能够同步且高效地与模板 DNA 结合，避免因 Tm 值差异过大而导致的扩增效率低下或非特异性扩增等问题。此外，引物的 3' 端是引物延伸的起始位点，应尽量避免出现连续的 G 或 C 碱基，因为这种结构可能会引发非特异性扩增，干扰实验结果的准确性。为了提高引物设计的科学性和准确性，可以借助专业的引物设计软件，如 Primer Premier 5 等，这些软件能够综合考虑引物的长度、Tm 值、碱基组成等多种因素，为实验人员提供更为优化的引物设计方案，有效提升目的基因扩增的成功率。

（2）PCR 反应体系 构建一个科学合理的 PCR 反应体系是实现目的基因高效扩增的关键环节。一个典型的 PCR 反应体系主要包含以下几种成分：模板 DNA、上下游引物、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、PCR 缓冲液以及去离子水。以下是一个常见的 25μl PCR 反应体系示例，各成分用量如下：

| 成分         | 用量    |

| 模板 DNA       | 1-5μl   |

| 上游引物（10μM）     | 1μl    |

| 下游引物（10μM）     | 1μl    |

| dNTPs（2.5mM）    | 2μl    |

| 10×PCR 缓冲液     | 2.5μl   |

| Taq DNA 聚合酶（5U/μl） |0.2-0.5μl |

| 去离子水        | 补足至 25μl |

在该反应体系中，模板 DNA 是目的基因的来源，其用量需根据模板的浓度和目的基因的拷贝数进行合理调整，以确保有足够的模板参与反应；上下游引物分别与目的基因的两端互补结合，引导 Taq DNA 聚合酶进行特异性扩增；Taq DNA 聚合酶是 PCR 反应的核心酶，它能够在高温条件下催化 DNA 的合成；dNTPs 作为 DNA 合成的原料，为新链的延伸提供必要的核苷酸；PCR 缓冲液则为反应提供了适宜的离子强度和 pH 环境，保障酶的活性和反应的顺利进行；去离子水用于调节反应体系的总体积，使各成分达到合适的浓度比例。

（3）PCR 反应条件 精准的 PCR 反应条件设置对于目的基因的高效扩增同样不可或缺，一般包括预变性、变性、退火、延伸以及最后延伸这几个关键阶段，各阶段的具体参数如下：

①预变性：在 95℃条件下持续 5 分钟，这一过程旨在使模板 DNA 完全变性为单链状态，同时也有助于消除模板 DNA 中可能存在的二级结构，为后续的引物结合和 DNA 合成创造有利条件。

 ②变性：将反应体系迅速升温至 95℃，维持 30 秒，使双链 DNA 模板再次变性为单链，为引物的结合提供机会。此阶段的高温条件能够有效打断 DNA 双链之间的氢键，确保模板 DNA 充分解旋。

 ③退火：根据引物的 Tm 值来确定退火温度，例如当引物 Tm 值为 55℃时，将反应体系降温至该温度并保持 30 秒。在退火阶段，引物与模板 DNA 单链按照碱基互补配对原则进行结合，形成稳定的引物 - 模板复合物，为 DNA 聚合酶的结合和延伸做好准备。

 ④延伸：在 72℃条件下进行延伸反应，延伸时间根据目的基因的长度来确定，一般按照 1kb/min 的速率进行计算。例如，若目的基因长度为 1kb，则延伸时间为 1 分钟。在此阶段，Taq DNA 聚合酶以引物 - 模板复合物为起点，沿着模板 DNA 的 5'→3' 方向合成新的 DNA 链，实现目的基因的扩增。

 ⑤循环次数：通常设置为 30-35 次循环，通过多次循环的变性、退火和延伸过程，使目的基因的拷贝数呈指数级增长，从而获得足够量的扩增产物。

 ⑥最后延伸：在完成所有循环后，将反应体系置于 72℃条件下持续 10 分钟，以确保所有未完全延伸的 DNA 链能够充分延伸至末端，提高扩增产物的完整性和质量。  

二、载体选择

在生物医学研究中，载体是实现目的基因表达和功能研究的关键载体，它就像是一艘精心设计的“运输船”，负责将目的基因安全、高效地运送到宿主细胞中，并确保其能够在细胞内稳定存在并发挥预期功能。因此，根据实验的具体目的和要求，选择一个合适的载体至关重要。目前，常见的载体主要包括质粒载体、噬菌体载体等，其中质粒载体因其诸多优势而被广泛应用于各类实验中。在选择载体时，需要综合考虑以下几个关键因素：

（1）复制原点 复制原点是载体能够在宿主细胞中自主复制的核心元件。一个有效的复制原点能够确保载体在细胞分裂过程中稳定地传递给子代细胞，从而维持载体在细胞群体中的存在。不同的复制原点具有不同的复制特性和拷贝数，这对于实验结果有着显著的影响。例如，pUC 系列质粒的复制原点能够使质粒在宿主细胞中达到较高的拷贝数，这在需要大量表达目的基因或者进行高通量筛选的实验中具有明显优势。高拷贝数的载体可以增加目的基因的表达量，从而提高实验的效率和成功率。然而，在某些情况下，过高的拷贝数可能会对宿主细胞的生长产生一定的负担，甚至引发细胞的应激反应，影响细胞的正常生理功能。因此，在选择载体时，需要根据实验的具体需求和宿主细胞的特性，权衡拷贝数与细胞生长之间的平衡，选择一个最适合的复制原点，以确保实验的顺利进行。

（2）抗性基因 抗性基因是载体筛选过程中不可或缺的标记元件。它为实验人员提供了一种简便、高效的筛选手段，用于区分含有载体的宿主细胞和未转化的细胞。常见的抗性基因包括氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。这些抗性基因编码的酶能够使宿主细胞对相应的抗生素产生耐药性。在含有相应抗生素的培养基中，只有那些成功转化并整合了含有抗性基因的载体的细菌才能够正常生长和繁殖，而未转化的细胞则会被抗生素杀死。这种基于抗生素筛选的机制极大地提高了筛选的准确性和效率，节省了实验时间和人力成本。例如，在进行质粒转化实验时，将转化后的细菌接种在含有氨苄青霉素的培养基上，经过一段时间的培养后，只有那些含有氨苄青霉素抗性基因的质粒载体的细菌能够形成可见的菌落，从而使得实验人员能够快速地从大量的细菌中筛选出含有目标载体的阳性克隆。此外，抗性基因的选择也需要考虑实验的整体设计和后续操作。不同的抗生素可能会对细胞的生长和代谢产生不同的影响，因此需要根据实验的具体情况选择合适的抗性基因，以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。

（3）多克隆位点 多克隆位点是载体上一段经过精心设计的特定序列，它包含多个不同的限制性内切酶识别位点。这一设计为实验人员提供了极大的便利，使得目的基因能够方便地插入到载体中。在质粒构建过程中，实验人员可以根据目的基因的序列特点和实验需求，选择合适的限制性内切酶对目的基因和载体进行酶切处理，然后通过 DNA 连接酶将目的基因插入到载体的多克隆位点中。多克隆位点的存在不仅提高了目的基因插入的灵活性和准确性，还能够满足不同实验对于目的基因插入方向和位置的特定要求。例如，在某些需要研究目的基因启动子活性的实验中，实验人员可能需要将目的基因插入到载体的特定位置，以便能够准确地监测其转录活性。多克隆位点的多样性使得这种精确的插入成为可能。此外，多克隆位点的设计还需要考虑限制性内切酶的酶切位点之间的兼容性和潜在的酶切位点破坏问题。在进行酶切操作时，需要确保所选择的限制性内切酶的酶切位点在目的基因和载体中是唯一的，以避免非特异性酶切导致的序列破坏。同时，在目的基因插入后，还需要检查插入过程中是否破坏了多克隆位点中的其他酶切位点，以确保载体的完整性和后续可能的进一步操作的可行性。一个精心设计的多克隆位点能够为质粒构建提供更多的选择和便利，提高实验的成功率和效率。

三、酶切反应

   1、反应体系准备 在进行酶切反应之前，需要在无菌的离心管中依次加入适量的 DNA、限制性内切酶、酶切缓冲液等成分，以构建一个适宜的酶切反应体系。以下是一个常见的 20μl 酶切反应体系示例，各成分用量如下：

| 成分       | 用量    |

| DNA      | 1-5μg  |

| 限制性内切酶（10U/μl） | 0.5-2μl |

| 10×酶切缓冲液    | 2μl   |

| 去离子水      | 补足至 20μl |

在该反应体系中，DNA 是酶切反应的底物，其用量需根据实验的具体需求和 DNA 的浓度进行合理调整，以确保有足够的底物参与反应；限制性内切酶是酶切反应的核心，其用量需根据酶的活性和 DNA 的长度进行优化，以保证酶能够充分切割 DNA；酶切缓冲液为酶切反应提供了适宜的离子强度和 pH 环境，保障酶的活性和反应的顺利进行；去离子水用于调节反应体系的总体积，使各成分达到合适的浓度比例。在准备反应体系时，需要注意操作的无菌性，避免 DNA 被污染，影响酶切反应的效率和结果。

2、反应条件 在反应体系准备完成后，需要轻轻混匀反应液，然后离心数秒，使反应液集中在管底，确保反应液的均匀分布。接下来，将离心管放入合适的温度下孵育一定时间，通常是 37℃孵育 1-3 小时。然而，并非所有的限制性内切酶都适用于 37℃的反应温度，有些酶可能需要在其他特定温度下进行反应，以发挥其最佳活性。因此，在进行酶切反应之前，必须仔细查阅所使用的限制性内切酶的说明书，了解其最佳反应温度和时间，并严格按照说明书的要求进行操作。例如，某些限制性内切酶的最佳反应温度可能为 30℃或 50℃，孵育时间也可能因酶的活性和 DNA 的长度而有所不同。此外，在酶切反应过程中，还需要注意反应液的体积和浓度对反应的影响。过大的反应体积可能会导致酶的活性降低，而过高的 DNA 浓度可能会使酶切反应不完全。因此，在实际操作中，需要根据实验的具体情况，对反应体系和条件进行适当的调整和优化，以确保酶切反应的高效性和特异性。

3、酶切产物检测

四、连接反应

   质粒构建过程中，连接反应是将酶切后的目的基因和载体精准连接起来，形成具有生物学功能的重组质粒的关键步骤。这一过程不仅需要精确控制反应体系的组成，还需要优化反应条件，以确保连接反应的高效性和特异性。以下是连接反应的详细步骤和注意事项： 1、反应体系准备 在无菌离心管中依次加入适量的酶切后的目的基因、载体、DNA 连接酶和连接缓冲液。目的基因和载体的摩尔比是影响连接效率的重要因素，一般推荐的比例为 3:1-10:1。较高的目的基因与载体比例可以增加目的基因插入载体的概率，从而提高重组质粒的成功率。以下是一个常见的 10μl 连接反应体系示例，各成分用量如下：

| 成分        | 用量     |

| 酶切后的目的基因     | 适量（根据摩尔比调整） |

| 酶切后的载体      | 适量（根据摩尔比调整） |

| T4 DNA 连接酶（3U/μl） | 0.5μl    |

| 10×连接缓冲液     | 1μl     |

| 去离子水       | 补足至 10μl  |

在该反应体系中，酶切后的目的基因和载体是连接反应的主要底物，其用量需根据实验的具体需求和摩尔比进行合理调整；T4 DNA 连接酶是连接反应的核心酶，它能够催化目的基因和载体之间的磷酸二酯键的形成，从而实现两者的连接；连接缓冲液为连接反应提供了适宜的离子强度和 pH 环境，保障酶的活性和反应的顺利进行；去离子水用于调节反应体系的总体积，使各成分达到合适的浓度比例。在准备反应体系时，需要注意操作的无菌性，避免 DNA 被污染，影响连接反应的效率和结果。

2、反应条件 在反应体系准备完成后，需要轻轻混匀反应液，然后离心数秒，使反应液集中在管底，确保反应液的均匀分布。接下来，将离心管放入合适的温度下孵育一定时间。通常有两种常见的孵育条件可供选择： 低温长时间孵育：将离心管放入 16℃的环境中孵育过夜（约 12-16 小时）。这种低温长时间的孵育条件有助于提高连接反应的效率，特别是对于一些较难连接的片段，低温长时间孵育可以增加连接酶的作用时间，提高连接的成功率。 室温短时间孵育：将离心管在室温（约 25℃）下孵育 1-2 小时。这种室温短时间的孵育条件适用于一些较为容易连接的片段，能够在较短的时间内完成连接反应，节省实验时间。

在选择孵育条件时，需要根据实验的具体需求和目的基因及载体的特性进行综合考虑。例如，如果目的基因和载体的末端较为稳定，且连接反应较为容易进行，可以选择室温短时间孵育；如果连接反应较为困难，或者需要更高的连接效率，建议选择低温长时间孵育。此外，在连接反应过程中，还需要注意反应液的体积和浓度对反应的影响。过大的反应体积可能会导致连接酶的活性降低，而过高的 DNA 浓度可能会使连接反应不完全。因此，在实际操作中，需要根据实验的具体情况，对反应体系和条件进行适当的调整和优化，以确保连接反应的高效性和特异性。

五、转化 

   1、感受态细胞制备 感受态细胞的制备是转化过程的第一步，也是决定转化效率的关键因素之一。感受态细胞是指经过特殊处理后，能够摄取外源 DNA 的细胞。制备感受态细胞的方法有多种，但最常用的是通过化学试剂（如氯化钙）处理细胞，使其细胞膜的通透性发生改变，从而能够摄取外源 DNA。在制备过程中，需要注意以下几点：

①细胞生长状态：选择处于对数生长期的大肠杆菌细胞进行处理，因为此时的细胞生长旺盛，代谢活跃，对转化过程的耐受性较强，能够提高转化效率。

 ②无菌操作：整个制备过程需在无菌条件下进行，以防止杂菌污染，影响后续的转化效果。

 ③温度控制：在制备过程中，需严格控制温度，如冰浴、热激等步骤的温度和时间，以确保细胞的活性和转化效率。

  2、热激转化

①感受态细胞的解冻与准备 取适量的感受态细胞（大肠杆菌），将其置于冰浴中缓慢解冻。缓慢解冻有助于保护细胞的活性，避免因温度骤变对细胞造成损伤。解冻后，将感受态细胞置于冰上待用，以维持其低温状态，确保细胞处于感受态。

②连接产物的加入与混合 向解冻后的感受态细胞中加入适量的连接产物，轻轻混匀。混匀时需注意动作轻柔，避免剧烈震荡对细胞造成损伤。然后将混合后的细胞置于冰浴中，保持 30 分钟。冰浴的目的是使连接产物与感受态细胞充分接触，同时维持细胞的低温状态，提高细胞对 DNA 的摄取能力。

③热激处理 将经过冰浴处理的细胞迅速转移至 42℃的水浴中，进行热激处理，持续 90 秒。热激处理是转化过程中的关键步骤，通过瞬间的高温刺激，使细胞膜的通透性发生短暂的改变，从而使外源 DNA能够进入细胞内部。热激时间需严格控制，过短可能导致转化效率降低，过长则可能对细胞造成不可逆的损伤。

④细胞的复苏与培养 热激处理结束后，立即将细胞转移至冰浴中，迅速冷却 2-3 分钟。迅速冷却有助于细胞恢复到正常状态，减少热激对细胞的损伤。随后，向细胞中加入适量的无抗 LB 培养基，将细胞置于 37℃的摇床中振荡培养 1 小时。振荡培养的目的是使细胞在适宜的温度和环境下复苏，同时促进外源 DNA在细胞内的稳定整合和表达。培养过程中需注意摇床的转速和培养基的量，以确保细胞能够充分接触培养基，获得足够的营养物质进行生长和代谢。

⑤菌液的涂布与筛选 培养结束后，将菌液均匀涂布在含有相应抗生素的 LB 平板上。抗生素的选择需根据重组质粒上携带的抗性基因来确定，如氨苄青霉素、卡那霉素等。涂布时需注意菌液的均匀分布，避免局部浓度过高或过低，影响筛选效果。将涂布好的平板置于 37℃的培养箱中倒置培养过夜。倒置培养的目的是防止培养基中的水分蒸发，保持平板的湿润度，有利于细菌的生长和形成菌落。

3、转化结果的筛选与鉴定

经过一夜的培养，含有抗生素的 LB 平板上会出现许多菌落。这些菌落中，只有部分是成功转化并含有重组质粒的阳性克隆。为了筛选出阳性克隆，需要进行进一步的鉴定。常用的鉴定方法包括菌落 PCR、酶切鉴定和测序等。通过这些方法，可以准确地筛选出含有正确重组质粒的阳性克隆。

4、注意事项

无菌操作：整个转化过程需在无菌条件下进行，包括感受态细胞的制备、连接产物的加入、热激处理、复苏培养以及菌液的涂布等步骤。

无菌操作是确保转化成功和后续实验顺利进行的关键。 

温度控制：严格控制各步骤的温度和时间，如冰浴、热激、复苏培养等。温度和时间的精确控制能够有效提高转化效率，减少细胞损伤。 

感受态细胞的质量：选择高质量的感受态细胞是提高转化效率的重要因素。

感受态细胞的制备方法、保存条件以及使用次数等都会影响其质量和转化效率。建议使用新鲜制备的感受态细胞，并严格按照制备方法进行操作。 

连接产物的量：加入连接产物的量需适中，过多可能导致转化效率降低，过少则可能影响阳性克隆的筛选。根据实验的具体需求和感受态细胞的活性，合理调整连接产物的加入量。 

培养基的选择：复苏培养时使用的无抗 LB 培养基需新鲜配制，确保其营养成分充足。同时，涂布筛选时使用的含抗生素 LB 平板需提前制备并保存在 4℃冰箱中，使用前需检查平板的质量，避免因平板质量问题影响筛选效果。