BSA 偶联棕榈酸钠/BSA 偶联油酸钠常温或低温析出、浓度不准确、细胞模型诱导不成功等

在体外研究中，为了模拟高甘油三酯和游离脂肪酸血症，通 常需要在细胞培养基中添加高浓度的游离脂肪酸（FFA）。油酸 （Oleic acid，OA）是人体内含量最丰富的游离脂肪酸，占血浆 游离脂肪酸总量的31%。油酸是一种单不饱和脂肪酸。正常情况 下，人体血液中油酸的浓度维持在生理范围内，血脂异常患者血 液中油酸浓度显著增高。油酸钠（Sodium oleate）是油酸的钠盐， 同等摩尔浓度的油酸钠与油酸对体外培养的细胞产生相同的作 用。因此，油酸或油酸钠被认为是体外模拟高甘油三酯和游离脂 肪酸血症的理想试剂。

在体外研究中，为了模拟2型糖尿病所致的器官损伤，除在细胞培养基中添加高浓度的葡萄糖外，通常需要添加高浓度的软脂酸（棕榈酸，Palmiticacid，PA），这是因为软脂酸是存在于动物、植物及微生物中最常见的游离脂肪酸。正常情况下，人体血液中软脂酸的浓度均值约为100umol/L，肥胖和2型糖尿病情况下血液中软脂酸浓度显著增高。软脂酸钠（棕榈酸钠，Sodiumpalmitate）是软脂酸的钠盐，同等摩尔浓度的软脂酸钠具有与软脂酸相同的细胞脂毒性。因此，软脂酸和软脂酸钠被认为是模拟细胞脂毒性的理想试剂。

油酸及棕榈酸难溶于水，但易溶于乙醇等有机溶剂中，所以， 一些实验者采用甲醇、乙醇、氢氧化钠溶液、异丙醇等有机溶剂配制油酸、棕榈酸及其钠盐，其缺点是这些溶剂本身对细胞就有毒性，而且这些溶剂是否影响试剂本身的性质也不清楚。所以使用有机溶剂配制的高脂试剂是不能用于细胞实验的。

此外，一些科研人员利用牛血清白蛋白（BSA）可与自由脂肪酸结合的特点，采用高浓度的BSA 溶液配制油酸、棕榈酸 及其钠盐。该方法的优点是溶剂本身对细胞无毒性，但仍存在 以下问题：

1）未对BSA 进行甄选，导致其结合力不足，导致溶解之 后很快有固体析出，呈浑浊或絮状，如下图所示：

常温或低温状态有沉淀或析出

2）采用不合理的溶解方法和设备，导致配制溶剂在低温 或室温下，出现析出、沉淀，试剂整体为絮状浑浊状态，如下 图所示：

常温或低温成絮状

上述两种情况，均会导致两个核心问题：

1）由于低温、室温出现沉淀，因此，在经0.22 uM 滤器过 滤除菌时，絮状未溶解的软脂酸（或其他脂肪酸、钠盐）是过 滤不掉的，会造成滤下去的溶液里软脂酸（或其他脂肪酸、钠 盐）的终浓度不准确且无法测量。

在细胞建模过程需要精准控制试剂浓度，但是由于上述技术问题，最终浓度在无法确定的情况下，实验其实是无法有效进展，出现的技术问题便无法进行有效分析。

2）由于BSA与棕榈酸钠、油酸钠结合方式不对，导致试剂在诱导损伤或诱导脂滴过程，效果极不稳定，经常出现无法复现的情况。

因为，此时并非溶解的油酸、棕榈酸及其钠盐，而是油酸、棕榈酸及其钠盐以固体微小颗粒的形式悬浮在溶剂中，当温度降低至40℃以下时，油酸、棕榈酸及其钠盐便会析出，所以有些文献中记载了高脂试剂使用前需要“培养基加热”、“培养基预热”、“55℃-60℃水浴助溶”等步骤。

但是细胞是在37℃孵箱里培养的，当加入助溶的高脂试剂后，把细胞放回孵箱，细胞培养基和高脂试剂的混合液温度便降低至40℃以下，此时，高脂试剂析出，以固体微小颗粒的形式悬浮在培养基中，不能如预期诱导细胞模型。上述情况下，即使同一批次的试剂，其效果也无法做到统一，严重耽误实验进度，悬浮状态如下：

大量未溶解呈漂浮状的PA

上图中，有析出沉淀的PA（300uM/mL）加入另一孔培养基里，有大量的未溶解呈漂浮状的PA，4倍镜下，晃动培养板尤其明显。

下图中，一个6孔板细胞，每个孔同样的密度，无沉淀的PA（300uM/mL）加入其中一个孔的培养基里，4倍镜下，晃动培养板，未见漂浮状物，上下两图可以有明显的对比。

4 倍镜下，晃动培养板，未见漂浮状物，完全溶解

因此，实验者应使用满足以下条件的高脂细胞添加剂建立细胞模型：

1）确保溶剂中不含氢氧化钠、其他碱性试剂及甲醇、乙醇、异丙醇等有机溶剂，确保溶剂无细胞毒性。

2）确保试剂在低温、常温状态下均不产生沉淀、析出或絮状物质，确保试剂稳定和浓度准确，如下图所示：

如上图所示，无论在室温还是4℃环境下试剂均应保持透亮、清澈状态。此时，即可保证加入到培养基的试剂浓度精准并能有效建立细胞模型，确保实验顺利进行。不再需要所谓的“培养基加热”、“培养基预热”、“分部稀释”、“55℃-60℃水浴助溶”等步骤，避免影响实验进度和可靠度。

浓度准确、无析出、无沉淀是实验成功的关键，部分高分文献（IF>10）如下，仅供科研学习和参考：

1)Liu, R. et al. MicroRNA-21 promotes pancreatic β cell function through modulating glucose uptake. Nat Commun. (2022)

2)Zhang, J. A.-O. et al. Lipid-induced DRAM recruits STOM to lysosomes and induces LMP to promote exosome release from hepatocytes in NAFLD. Sci Adv. (2021)

3)Lai, Z. Z. et al. Single-cell transcriptome profiling of the human endometrium of patients with recurrent implantation failure. Theranostics. (2022)

最后，祝大家实验顺利，感谢阅读，有问题欢迎交流。