流式细胞术检测细胞凋亡实践操作及成功秘诀和失败避坑

一、概述

流式细胞术 (Flow Cytometry, FCM) 是一种在液流中快速检测细胞特性的技术。它通过将单个细胞与带荧光特异性抗体或染料结合，对细胞进行多参数定量分析，包括细胞表面标记、细胞内蛋白质表达、细胞周期、DNA含量等。流式细胞术具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点，广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学等领域¹。

（图1 流式细胞术检测基本示意图） 

二、实验原理

在流式细胞仪中，细胞被包裹在鞘液 (sheath) 中，通过喷嘴以一定的速度射出。当细胞依次通过激光束时，激光束会照射到细胞并产生光信号，光信号被检测器收集并转换为电信号，再传输到计算机进行进一步处理和分析。由于每个细胞待测抗原数量不同，因此光信号的强度也不同，从而可以对每个细胞进行多参数定量分析。 光信号包括散射光信号和荧光信号，散射光分为前向散射光 (forward scatter, FSC) 和侧向散射光 (side scatter, SSC) ，其强度由细胞的物理性质决定，如细胞大小、细胞内部结构复杂程度。荧光信号(fluorescence) 由待测抗原结合荧光偶联抗体后，受到激光束的激发而产生²。

（图2 流式细胞术基本原理）

流式细胞术检测细胞凋亡Annexin V染色法是一种通Annexin V荧光标记技术区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的高效方法。其核心基于细胞凋亡过程中磷脂酰丝氨酸（PS）外翻、Annexin V（钙离子依赖性蛋白）特异性结合外翻的PS，标记为绿色荧光（FITC通道）³。

（图3 流式细胞术凋亡检测分群图）

三、实验材料

1.试剂：

（1）Annexin V-FITC/PI染试剂盒（含结合缓冲液）

（2）无EDTA胰酶（贴壁细胞专用）、1×PBS、4%多聚甲醛（可选）

（3）完全培养基（含10% FBS）。

2.耗材：

流式管、细胞滤网（200目）、15 mL离心管、微量移液器。

3.设备：

流式细胞仪、CO₂培养箱、离心机、倒置显微镜。

四、实验步骤

（一）样本制备

1.细胞处理：

贴壁细胞：用无EDTA胰酶消化（避免过度消化导致假阳性），离心（300×g，5 min）后PBS洗涤2次。

悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤。

2.细胞重悬：

用预冷1×结合缓冲液调整细胞密度至1×10⁶/mL。

（二）染色操作

1.染色体系：

取100 μL细胞悬液，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，避光混匀，室温孵育15 min。

2.终止染色：

加入400 μL结合缓冲液，4℃避光保存，1小时内上机检测。

（三）流式检测

1.仪器校准：

使用阴性对照和单阳对照（Annexin V⁺或PI⁺）调节电压和荧光补偿。

2.数据采集：

设置FSC/SSC散点图圈门排除碎片，分析各象限细胞比例。

五、注意事项

1. 避免EDTA干扰：

贴壁细胞消化后需彻底洗涤以去除EDTA，防止其螯合钙离子影响Annexin V结合。

2. 避光操作：

 Annexin V和PI为光敏染料，全程避光，染色后尽快检测（1小时内）。

3. 轻柔处理细胞：

吹打细胞时避免机械损伤，离心速度不超过300×g，防止假阳性坏死信号。

六、遇到问题及解决方案

1.假阳性率高：

原因：胰酶消化过度、PI染色时间过长、残留EDTA。

解决：缩短消化时间（贴壁细胞）、染色后立即检测、彻底洗涤细胞。

2.补偿调节困难：

原因：单阳对照未设置或荧光溢出。

解决：单独使用Annexin V-FITC和PI单染管调节补偿。

3.细胞数量不足：

原因：初始细胞密度过低或离心损失。

解决：确保细胞密度≥1×10⁶/mL，离心后保留少量液体覆盖沉淀。

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参考：

1： Robinson JP, Ostafe R, Iyengar SN, Rajwa B, Fischer R. Flow Cytometry: The Next Revolution. Cells. 2023 Jul 17;12(14):1875. doi: 10.3390/cells12141875. PMID: 37508539; PMCID: PMC10378642.

2：Adan A, Alizada G, Kiraz Y, Baran Y, Nalbant A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 2017 Mar;37(2):163-176. doi: 10.3109/07388551.2015.1128876. Epub 2016 Jan 14. PMID: 26767547.

3：Lakshmanan I, Batra SK. Protocol for Apoptosis Assay by Flow Cytometry Using Annexin V Staining Method. Bio Protoc. 2013 Mar 20;3(6):e374. doi: 10.21769/bioprotoc.374. PMID: 27430005; PMCID: PMC4943750.