求解细胞养不好的原因

我养的是大鼠muller细胞系,从今年3月份开始养,一直都养的很好,胰酶消化1分钟左右就可以了。
从今年8月到现在,细胞总是在复苏第二天或者第三天出现死亡,不贴壁,或者贴壁的变得扁平无光泽,不饱满。
曾经怀疑是污染,试过出现这种情况之后继续换液,观察到贴壁的无光泽的细胞在换液后好几天一直无增殖,培养基也一直都是清澈的,没有出现可疑的黑点或其他菌丝。于是用胰酶消化,发现同种品牌的胰酶,消化5分钟以上都消化不下来,怀疑细胞已经死亡,就丢弃了。
具体情况如以下所示:
细胞复苏第一二天,或传代的细胞第一二天,培养瓶尾部细胞成片不贴壁,贴壁的细胞也无光泽,扁平,培养基漂浮很多死细胞。如图:


用胰酶消化5分钟以上,消化不下来(平时消化1分钟就可以了),镜下如图:


尝试过很多方法寻找原因,包括更换培养基,血清,pbs和胰酶;从公司重新买新的细胞培养;去别的实验室培养箱进行培养等等,都在培养的第二三天出现了同样的情况。
求问,这究竟是什么原因?我还能通过什么方法尝试寻找原因呢?这个问题已经困扰我两个月了。这个细胞我之前一直养的很好,从8月开始就一直是这种情况。
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 2888