细胞反复污染的原因排查系列之总结与经验分享

各位园友们，大家好，临近毕业，在刚忙完我的毕业大论文的撰写和查重后，决定抽空对这个系列做个总结。从2021年8月13日第一次发现细胞反复污染至今，我已经陆续发布了6个相关帖子，第一个帖子已经有1.3万次浏览、86次讨论和173次收藏细胞反复污染的原因排查，不禁让我感慨竟有这么多的相似情况，对于每一个帖子的评论我都有认真的查看和回复，但鉴于自己的经验有限，不能一一解决你们的问题，实在抱歉。

下面就我自己对细胞反复污染这个问题的看法和处理做个总结，如有不足之处，还望各位互相讨论。

1、当你遇上细胞污染时，首先大概判断下是哪种微生物污染，常见细胞污染的信号有：

A、细胞培养液酸碱度的变化（更红/更黄了）；

B、培养液变浑浊甚至有股酸臭味了；

C、细胞增殖缓慢；

D、显微镜下可观察到丝状物（如真菌）/运动的颗粒物（如黑胶虫）等等。

具体的常见细胞污染类型大概有以下几种（图源网络）：

A、细菌污染

肉眼可见培养瓶底部有一层白色的薄膜，培养基浑浊变酸变黄呈云雾状，镜下观察有自由行动的颗粒，细胞状态差、基本死亡、看不到正常细胞形态。在高倍镜下看到的有可能是一些细胞状态不好分泌的杂质，也有些是细胞凋亡后的碎片。通常凋亡细胞的裂解产物对正常细胞生长是不利的（比如溶酶体的释放），所以有的话建议通过换液的方式去掉。这些小黑点会有布朗运动，看上去跟细菌一样会动，区别在于细菌的形态是每个点都几乎一样，而且能看到某些黑点会向某一方向移动较长的距离（杆菌的话在高倍镜下常有2根短杆状的菌体黏在在相互扭动，有臭味），而碎片一般是在原地来回反复地振荡，而且数量也不会增多。培养基是否浑浊和细菌密度有关，污染初期数量不多是不浑浊的。

B、霉菌污染

培养液清亮，肉眼看到培养瓶有团块的霉菌斑/菌落，可见絮状漂浮物，显微镜下看到霉菌的菌丝，呈细束纤维状或较为密集的孢子团块，呈细丝竹节管状；污染初期pH稳定，严重后迅速升高。

C、酵母菌污染

肉眼看到培养瓶颜色变得浑浊，显微镜下看到小的酵母颗粒。

（注：真菌通常倾向于聚集生长，在培养体系内形成“毛茸茸”的菌落，或丝状菌体，但一般不出现培养基变酸等现象。）

D、白色念珠菌污染

肉眼看到培养瓶颜色变得浑浊，显微镜下看到一串一串的白色念珠菌。

E、支原体污染

细胞会长的慢，量少时培养基不会浑浊，对细胞影响较小，但支原体增殖速度快，逐渐影响细胞生长，细胞边缘不清晰，培养基逐渐浑浊。支原体在没做特殊处理的情况下无法用普通光镜观察到，只能买个支原体检测试剂盒定期检测一下/支原体抑制剂处理、日常预防。

F、真菌污染

细胞培养基清亮不变色，镜下可见毛毛的白色丝状漂浮物，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不像细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。

2、细胞污染的处理

一旦发生污染，多数将无法挽回，直接丢弃后用酒精/84消毒液、紫外照射对培养箱进行消毒。应预防为主，加强无菌操作的训练。最重要的是预防，因为细胞一旦污染，想救是非常困难的，即便救活，细胞状态也会变差，进而影响实验结果。

3、关于杂质

A、不动的黑点：杂质用3ml PBS洗去。

B、动的黑虫子（黑胶虫，目前关于它的本质还说法不一，要在高倍镜下才能看到，培养基内有能动的小黑点、高倍镜下可见黑色小虫游走、会穿梭的黑色点状颗粒）：先用3ml PBS洗，再用3ml左氧洗后倒去。量少时培养基不浑浊，一般不会太影响细胞，细胞还是可以用的，细胞生长旺盛后可能会自行消失，可更换血清处理。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理，也可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。

黑胶虫污染具有5个特征：

①细胞状态差 ②低倍下呈黑色点状 ③高倍下做布朗运动 ④培养基不浑浊 ⑤与细胞数量成反比。

可以把含团状漂浮物的培养基/含有黑点的培养基单独吸到一个新的细胞瓶中培养一两天看看，通过数量和大小的变化来判断是否是污染，如果在没有细胞的情况下黑点也能在短时间内大量增殖，那大概率是污染了；细胞碎片和凋亡细胞只会随着细胞状态的变差而变多，通常增长不快。

4、若细胞发生污染，想要排查试剂原因的话，可以做个空培。验证方法用单一变量法：

先把每种试剂：基础培养基、FBS、PBS、完全培养基、不加双抗的完全培养基和冻存液吸取少量到6孔板，放在培养箱过夜/2天（因为4℃冰箱温度低不利于细菌的生长，拿来涂片不易找得到。如果肉眼和显微镜看不到细菌污染也不能排除污染，因为细菌会依附在细胞上，空培没有细胞，细菌又很小很难看到，所以最长可放置7天，若7天后还没有污染迹象就可以排除！）后离心：12000rpm、1min，弃去上清留下少许液体重悬沉淀后涂片、风干后滴加结晶紫染液1min后用少量慢速清水在上面冲洗3次（不要对着涂片的位置冲！），在吸水纸3个不同位置各压干一次后滴一滴香柏油到载玻片后在油镜下观察有无细菌。镜下形态规则、两头染色深中间染色浅的长杆状是杆菌；形态是正圆光滑的球状、整个球形染色深的是球菌（大小都不是很大的），其它形态不规则、过大/过小、一大片的可能只是杂质和细胞膜碎片等等。此方法即为革兰氏染色法，是最常用的细菌染色法，结晶紫也可称之为龙胆紫，是碱性染料。当它溶解后，可以被活细胞摄入，同时可以使DNA、蛋白质、脂肪着色。染色显示细胞核（与核酸结合）呈蓝色，细胞质呈粉红色。肉眼显示整个细胞呈深蓝色。

5、我之前前后花了大概2个多月在找污染的原因，但最后还是没有很确定，只能高度怀疑是冻存环境有问题，因为每次传代时细胞都很好，然后进行冻存部分细胞，但是一复苏就污染，真的是太奇怪了。所以，我想跟污染过的同胞说的是，如果你也花了时间去找原因但就是找不到，请停止再去找了，直接把所有的试剂、耗材甚至又可能连细胞也要全部换新重新做实验，因为与其花费大量时间去寻找原因，不如花点金钱重新开始，这是最高效的方法，也是我的肺腑忠告。

6、最后祝大家看完能有所收获，细胞不再污染、实验有所进展！

汪潮潮

2022年3月26日于蚌埠医学院