求助！真核表达蛋白表达量低，蛋白纯化后wb能看到，但是考染和银染都检测不到咋办

各位大神好，我是真核表达的，蛋白在胞内，表达量很低，但是能做的都做了，就想着增加细胞量来增大表达。然后用大概瞬时转染到s2细胞，收集细胞大概20ml，加细胞裂解液进行纯化。纯化的具体步骤：用两倍柱体积的pbs平衡柱子离心两分钟弃掉（之前也用tris平衡过但是效果不如pbs），加入蛋白裂解液，4°旋转孵育一小时，离心两分钟，接着用20mmtris盐酸，150mm氯化钠，再加入图片中的不同浓度咪唑分别洗脱，之后发现wb能检测到目标条带，但是银染结果看不到，这是为什么呢。然后在过夜透析后有很多沉淀，里面还有我的目的蛋白，又如何在不影响蛋白活性下溶解蛋白呢？透析之后，我想着超滤浓缩一下，我的蛋白70kd左右，但是实验室的超滤管只有10k的，超滤了5个小时浓缩不到一半，收集做wb发现蛋白浓度反而更低了，我现在很茫然，求各位大神赐教，不知道接下来做啥了呜呜