【请教】免疫组化双染
切片,37℃烘干
60℃烘箱里面2小时
二甲苯中脱蜡5-10分钟。
换用新鲜的二甲苯,再脱蜡5-10分钟。
无水乙醇5分钟。
90%乙醇2分钟。
70%乙醇2分钟
蒸馏水2分钟。
0.3%H2O2 37℃孵育30分钟
蒸馏水冲洗,PBS冲洗5分钟 ,3次
微波炉抗原修复
10%正常horse血清封闭,37℃孵育30分钟。
倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的兔抗第一抗原一抗工作液,4℃过夜。
PBS冲洗,5分钟×3次。
滴加辣根酶标记二抗工作液,37℃孵育30分钟。
PBS冲洗,5分钟×3次。
AEC显色剂显色。
10%正常horse血清封闭,室温孵育10分钟。
倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的鼠抗第二抗原一抗工作液,4℃过夜。
PBS冲洗,5分钟×3次。
滴加辣根酶标记二抗工作液,37℃孵育30分钟。
PBS冲洗,5分钟×3次。
DAB显色剂显色
自来水充分冲洗,复染,封片。
疑虑:
(1)我用的是VECTOR公司的双染色试剂盒,它的酶标二抗是即可以抗兔也可以抗鼠,即是同一种二抗。不只可以吗?
(2)有帖子说DAB影响其他显色剂显色,所以我先用AEC显色,不知道可以吗?
(3)AEC显色剂不能和二甲苯接触,那我的这种程序中设计是否合理呐?
(4)加完第一抗原的显色剂后,是否需要苏木素复染?还是直接进行第二抗原的染色程序?