免疫组化小技巧

1、  取材时要尽量去除血液的干扰：小鼠麻醉后，从左心耳插入针头，心尖处剪开一个小口，然后将PBS缓慢打入心脏中，缓慢跳动的心脏会将PBS运送至全身。50ml的PBS用量对于Balb/c或昆明小鼠的体积而言就已足够，这一步骤对于像肺、肝和脾脏这样血管丰富的脏器取材极为重要。

2、  取材时要尽量做到表面积大、厚度小：理想的取材厚度是2mm，这样的尺寸可以让后续的固定、脱水等操作达到理想的效果。器材选择上，手术刀和超市购买的刀片都可以，只要刀片锋利即可，切勿反复切割揉搓组织。因为脏器的表面都是弧形，并且质地很软，如果你直接取材，第一是不好切，第二是弧形的一面肯定是厚度超标，所以这里建议各位将组织置于碎冰上后，沿着长轴在横切面处再切一刀取材（针对实质性器官，且不要求取材部位）。

3、  取材后的组织需立即固定：固定不仅是要保留组织原有的形态，也是在保留组织中的抗原。组织离体取材后需立即固定，尽量不要超过20分钟。固定液的量一般为组织的10-20倍。

4、  抗原修复的条件极为重要：抗原修复是为了挽救在固定过程中被掩盖的一部分抗原特性，可以将盛有修复液的广口容器放在电磁炉中加热至沸腾，然后将切片放入其中修复液中加热30分钟，修复液的量要保证完全覆盖切片，且不会蒸发至干涸，抗原修复过后要让其缓慢降至室温。抗原修复液多选择pH6.0的柠檬酸盐修复液，优点是染色背景较清晰，假阳性结果较少。

5、  设置对照实验：严谨的实验要求有阳性对照和阴性对照。这里的阳性对照和阴性对照和我们实验中比较的加药组和非加药组是两个概念，这是新手们容易误解的地方。我们在文献中很少看到阳性对照和阴性对照的图片，所以有很多新手在免疫组化实验中并不做这两组实验，这里还是建议，如果开启一个新的研究方向，对照组实验还是要做的，并且也有在投稿过程中要免疫组化对照组原始图片的情况，其重要性可见一斑。

6、  结果判读：对于免疫组化结果而言，最怕的就是不同的人看到的结果是不一样的。结果判读看重的主要是两点：

a、阳性结果。肉眼可见的阳性结果就是黄色深浅，但并不是说黄色就是阳性了。首先不排除组织本身自带的抗原表达情况，同时也有很大程度的假阳性结果的干扰，所以黄色要结合阳性和阴性对照而言，这也就回到上一条所说的，设置对照组的重要性！

b、阳性部位。蛋白的定位可以通过很多方式查询，包括文献、抗体说明书、专业网站等。

7、   常见问题处理办法：a)非特异性染色是最常见的问题，刨除目的蛋白的定位，其余部位仍显示黄色就可以判定片子出现了非特异性染色。非特异性染色出现的原因：EDTA或Tris作为抗原修复液、干片、抗体的选用以及封闭时间。如果不是特殊的目的蛋白，建议选用柠檬酸盐作为修复液，在保证制片过程中不出现干片的同时，适当延长封闭时间，并选用单克隆抗体。干片最容易造成非特异性染色。