免疫组化过程中问题及分析

No.1 切片染色深

问题原因:一抗浓度过高是造成切片染色深常见的原因之一。

解决方法:是在每次使用新抗体前对其工作该度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己寸验室的理相工作浓度，包括

即用型的抗体也同样需要进行测试，不能只简单的按照说明书进行染色，

No.2 时间过长或温度过高影响实验结果

问频原因:忽视操作规程，没有严格控制时间，因遗忘而造成时同延长或温度过高

解决方法:实验人员应当严格执行操作规程，随身像带报时表或报时钟，及时提醒。规在流行的二步法敏感性很高，要求一

抗孵育的时间不是传统的1小时，而是 30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

No.3 DAB显色不理想

问题原国:DAB 变质或显色时间太长。

解决方法:DAB 最好现用现配，如有沉渣，应进行过滤后再使用，当染色片太多或使用染色机，导致无法及时进行终止操作时，也应该尽量对新的，或使用频率不高的抗体，进行显色时的监控，避免显色时间过长。

配子的 DAB 不应存放时间大长，因为在没有酶的情况下，过复化包也会游商出策原子片 DAB 产生反内，从而降低 DAB 的效力:像未用弃的 DAB 存放在水箱里，乘要的时候再取用的这种行为也是不可取的，DAB 的显色是好在是微镇下监控，符达到理想的染色程府时，应立即终北反应。

No.4 组织变干

问题原因:修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因

解决方法:实验人员在操作过程中要做到仔细认真，井采用 DAKO 笔或 PAP Pen 在组织周围画圈，达到有效的避免液体流失，提高操作速度的效果。

No.5 切片背景着色

问题原因:切片在缓冲液或修复液中浸泡时间大于 24 小时，并切放置在室温下，特别是炎热的夏天，就会出现背景着色。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在 40C冰箱过夜，对结果无明显影响。

解决方法:室温下不可存放时间太长，尤其是夏天，切片和修复液如需过夜，最好存放在 40C 冰箱内。

No.6 切片不显色或者背景着色

问题原因:一抗变质、质量差的多克隆抗体，是导致切片不显色或者背景着色的主要原因

解决方法:一定要注意一抗的有效期，用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

No.7 非特异性染色

问题原因:忘记血清封闭，在免疫组化中使用封闭血清，可以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。

解决方法:封闭血清一般选择和二抗来源相同的，因此常用山羊血清，有时也会使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不可与一抗来源相同。

No.8 操作过程中脱片

(1)可能是黏附载玻片质量的问题，建议尝试更换载玻片。

(2)组织切的不好，可能是切片机刀片较钝造成切片切的厚、不均匀，或者是切片机操作者手法不熟练等。

(3)可能是组织的问题，比如癌症组织有坏死情况时，也容易造成脱片。

(4)烘烤结果不理想，可能是烘烤时间较短或温度不够等。

(5)操作时甩动幅度过猛，有脱片嫌疑的切片最好不甩或轻轻甩，可用卫生纸从边缘上慢慢吸水

(6)修复过程出现问题，比如在抗原修复时，高压时间过长，或者放进 100 度修复液时不够平稳，也容易

出现脱片的情况。此外，用 EDTA 修复比柠檬酸更容易脱片。

(7)一旦见到有组织漂起来，在操作时就要更加谨慎，使用 PBS 的时候尽量泡，不要冲。