提取血清中 microRNA 及后续实验
Q：广大科研家人朋友们，我想请教一下，提取血清中microRNA
A1：1.提取血清中microRNA时，最好用专用的microRNA提取试剂盒呢？还是TRIZOL方法提取也可以呢？
2.逆转录分别用目的microRNA的茎环结构下游引物去逆转录、内参基因U6的常规下游引物去逆转录就可以是嘛？
3.qPCR的试剂选择普通的SYBR方法就可以嘛？因为确实看到一些需要用探针法上定量PCR检测的
1. 对于血清中的microRNA的提取，专用的microRNA提取试剂盒和TRIZOL方法都是可以的。试剂盒通常更加方便，而且更容易获得高质量的RNA，尤其是对于microRNA这种较小的RNA分子。然而，TRIZOL方法也可以有效提取RNA，包括microRNA，只是可能需要更多的优化。具体选择哪种方法，取决于你的实验室条件和预算。
2. 通常情况下，对microRNA的逆转录是需要使用特定的microRNA的茎环结构下游引物的，同时你也需要一个内参基因，比如U6，来校准和控制你的实验条件。这个内参基因的引物通常是常规的下游引物。
3. 对于qPCR的试剂，普通的SYBR Green方法是可以的，尤其是在预算有限的情况下。但需要注意，SYBR Green是会与所有的双链DNA结合，所以有可能会检测到非特异性的扩增产物。探针方法如TaqMan则更为特异，因为它们设计的探针只有在目标序列存在时才会发出信号。所以选择哪种方法，又一次取决于你的实验需求和预算。
A2：提取血清中microRNA，TRIZOL方法也可以提取。建议使用专用试剂盒提取更好。
A3：有专门的提取试剂盒，trizol方法也可以用于提取，就是纯度和效率可能不如专门的试剂盒
Q：为什么核酸的纯度是以OD260/OD280的比值作为检测标准？有没有其他的检测标准呢
A1：这是因为核酸在260nm处的吸光度最大，而蛋白质则在280nm处吸光度最大。因此，OD260/OD280的比值可以用来估计样品中核酸和蛋白质的相对含量，从而评估核酸的纯度。
理想情况下，DNA的OD260/OD280比值应接近1.8，而RNA的比值应接近2.0。如果比值低于这些数值，通常表示样品中蛋白质的含量较高，即核酸的纯度较低。
除此之外，还有其他的一些方法可以用来评估核酸的纯度和质量，比如凝胶电泳可以用来直观地评估核酸的大小和完整性。更为先进的方法如Bioanalyzer或TapeStation等可以提供更为详细的信息，包括核酸的大小分布、浓度和纯度等。
A2：因为核酸中影响纯度的物质是蛋白质，而蛋白质在260处是没有吸光度的，所以是看DNA或者RNA的纯度，可以通过OD260/0D280比值来衡量，DNA的 OD260/0D280比值在1.8-20; RNA的 >2.0。如果比值< 1.8，说明有蛋白质残留
A3：OD是optical density (光密度)的缩写，OD=1og (1/trans) ，其中trans为检测物的透光值。吸光度是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。当一束光通过一-个吸光物质(通常为溶液)时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。蛋白中trp、tyr、phe的吸光度为280nm常用来表示蛋白质吸光度；而260nm为DNA的吸光度，此方法是唯一通用的判定方法。
Q：求助各位大神，知道了circRNA的染色体起止位置，怎么才能知道它的ID呢？样本是大鼠组织
A1：可以在national center for biotechnology information 网站进行查询。
A2：可以上ncbi网站输入rna的序列进行查询
Q：我只做细菌同源性比对、SNP和inDel分析、耐药基因注释和突变，请问做测序草图够用吗？
A1：对于细菌同源性比对、SNP和InDel分析、耐药基因注释和突变等分析，使用测序草图可能并不够。测序草图（sequence reads）只是原始测序数据的简单展示，无法提供详细的注释和分析结果。
为了进行这些分析，通常需要进行以下步骤：
1. 数据质量控制：对原始测序数据进行质量控制，包括去除低质量序列、去除适配体序列和质量修剪等。
2. 比对和装配：将质量控制后的序列比对到参考基因组或相关数据库，以确定序列的同源性。对于细菌同源性比对，可以使用工具如Bowtie、BWA、BLAST等。对于SNP和InDel分析，可以使用工具如GATK、SAMtools等。
3. 变异检测和注释：根据比对结果，检测SNP、InDel等变异位点，并进行注释，如确定其在基因组上的位置、功能影响、耐药性等。
4. 数据可视化和分析结果呈现：根据分析结果，生成相关的图表、图像或报告，以便直观地展示和解释分析结果。
测序草图通常只是进行数据处理和分析的第一步，它提供了原始序列信息，但无法满足详细的注释和分析需求。因此，在进行细菌同源性比对、SNP和InDel分析、耐药基因注释和突变等分析时，建议使用适当的生物信息学工具和软件，进行更全面和准确的数据分析。
Q：请问同源重组的连接产物有什么特点吗 可以用于电转吗
A1：重组的产物称为重组DNA（recombinantDNA），所有的DNA都是重组DNA。
DNA重组类型:
共3种类型,分别是同源重组、特异位点重组和转座重组。
(2)主要特点:
①同源重组:同源重组发生是依赖大范围的DNA同源序列的配对。重组过程中,两个染色体或DNA分子交换对等的部分。其特点是:需要重组的蛋白质参与;蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高;真核生物染色质的状态影响重组的频率。
②特异位点重组的特点:重组依赖于小范围同源序列的配对,发生精确的断裂、连接,DNA分子并不对等交换。
③转座重组的特点:完全不依赖于序列间的同源性而使一段DNA序列插入另一段中,但在形成重组分子时往往是依赖于DNA复制而完成重组过程。
A2：同源重组的特点：A.涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大。B.需要重组酶C.涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程（异源双链区的生成）D.单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号。E.存在重组热点。可以用于电转。
A3：同源重组的连接产物主要特点是它包含了插入片段与目标基因序列的相应部分。这种相应部分可以和目标基因的特定区域通过同源配对和重组，将插入片段导入到目标基因中。此过程常见于基因工程实验，例如通过酵母或者细菌的同源重组系统进行基因编辑。
在同源重组后得到的连接产物是可以进行电转的。电转，即电穿孔，是一种常用的细胞转化方法，它可以使细胞膜形成短暂的孔隙，从而让外部的DNA片段进入细胞内。在实验中，研究人员通常会将同源重组的连接产物电转入细菌或酵母细胞中，然后通过选择标记和PCR等方法筛选出成功接入目标基因的菌株。
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最后编辑于 2023-06-15 · 浏览 763
