ECM细胞外基质水凝胶在女性生殖医学中的未来挑战和机遇

1.引言

男性和女性因素对不孕有同等的影响，定义为尽管在一年内定期进行无保护性交，但仍无法实现临床妊娠。然而，根据现有文献和我们的研究背景，International Journal of Molecular Sciences 特刊(Smart Hydrogels and Hydrogels Composites: Current Challenges and Opportunities)的这篇综述将重点关注女性生殖系统。女性生殖系统由四个主要器官组成：卵巢或女性性腺；输卵管，也称为输卵管，连接卵巢和子宫，并发生受精；子宫，负责胚胎植入和胎儿发育；阴道将子宫颈连接到外部结构，对性交和新生儿分娩至关重要。

针对女性生殖系统疾病的临床方法越来越多地利用生物工程不仅提供独立的治疗，还提供增强剂或载体，以支持或治疗疾病（子宫内膜异位症、子宫腺肌病或感染）、疾病（卵巢早衰、子宫内膜或阴道萎缩或子宫息肉）、，综合征（Asherman或Mayer–Rokitansky–Küster Hauser），甚至组织保存过程（卵巢皮质和卵母细胞冷冻保存）。生物工程取得了令人难以置信的进步，推动了生物和医学科学的许多技术进步，这些进步随后转化为妇科领域的不断进步。

特别是水凝胶，是一种有前途的、引人注目的技术。水凝胶是由含水量超过90%的交联聚合物组成的三维（3D）微环境。这些水基支架具有良好的延展性和非粘性，易于应用，例如可注射形式。此外，水凝胶可以支持细胞/组织增殖和生长，这是组织再生疗法的关键。水凝胶根据离子电荷、生物降解性、交联、物理 特性、生化反应或制备方法等特征以及来源进行分类：天然、合成或混合。水凝胶适用于不同的目的，包括治疗递送（例如，蛋白质、药物或干细胞）、组织环境模拟或组织再生。

水凝胶在20世纪开始用于妇科领域，最初的报告来自动物模型。测试的应用包括在子宫内粘连、卵巢早衰和阴道萎缩的小鼠模型中使用胶原水凝胶携带干细胞或生长因子。其他天然水凝胶，例如由藻酸盐组成的水凝胶，可以模拟小鼠卵巢冷冻保存前的天然微环境。这些天然水凝胶的价值在于其生物相容性、生物降解性、非免疫原性和这些生物材料固有的无毒性。然而，这些天然材料的局限性主要取决于其机械特性（例如，凝胶化时间、变形或弹性）；因此，一些方法结合了天然和合成来源的水凝胶。

水凝胶旨在重建的3D原生细胞环境比仅由胶原蛋白、透明质酸或合成替代物组成的支架更复杂。这种周围环境被称为细胞外基质（ECM），它被定义为非细胞3D网络，由提供结构和功能支持的多种大分子（胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖（GAG）或层粘连蛋白等）组成。基质中分子的类型及其相互作用影响细胞行为和其他生物过程（例如，GAG向细胞受体提供生长因子，交联基质释放化学和旁分泌信号等）。因此，脱细胞天然ECM的使用成为简单天然或合成水凝胶的有力替代品。脱细胞ECM负责支持不同组织和细胞组织的复杂网络，提供3D结构，并参与细胞/组织及其微环境生态位之间的稳态、相互作用和粘附。

脱细胞过程（在过去几年中描述得很好）对于获得功能性ECM至关重要。器官脱细胞是通过物理（例如，冷冻和解冻、搅拌或加压）、化学（例如，洗涤剂、溶剂和离子溶液）或酶（例如，胰蛋白酶或胶原酶）方法实现的，这些方法旨在去除细胞和抗原表位的同时保留蛋白质支架结构。这是生产天然水凝胶最常用的技术之一，该过程证明了许多器官的成功，例如心脏、肝脏、胰腺和肾脏。脱细胞ECM水凝胶的物理和化学特性对于实现其临床功能至关重要。这些特性不仅取决于天然组织及其机械特性，还取决于脱细胞方法或最终灭菌方法。因此，对这类生物材料进行适当和准确的表征是其应用前的关键。

ECM水凝胶在妇科领域有着新兴的应用，并具有良好的临床前结果。因此，本文献综述提供了ECM水凝胶的整体概况，包括描述其在体外模型中的开发和使用以及在临床前研究中的体内应用的研究。我们讨论了在生殖医学中使用器官特异性ECM水凝胶的最新进展，考虑到跨越整个女性生殖道的研究。最后，我们介绍了ECM水凝胶在不久的将来应用的潜力和可能范围。

2.ECM水凝胶，概述

2.1概念化和历史背景

1948年的第一份粗脱细胞技术报告导致了几乎所有组织和器官的许多脱细胞方案的设计和实施。所有这些技术的共同目标是实现有效的细胞和表位去除，同时最好地保留ECM的天然成分和结构。20世纪80年代的工作取得了突破，将无细胞小肠粘膜下层（SIS）用作组织重建的生物支架。自那时以来，自体和异种脱细胞ECM衍生材料已获得国家卫生机构批准用于人体，许多临床前和临床研究证明了这些材料对多种组织的安全性和有效性，如骨骼系统、皮肤和心脏。

ECM支架（固体天然基质）可以通过溶解、中和和凝胶化而成为水凝胶，这一发现扩大了其体外潜力和体内应用。ECM水凝胶保留了表征ECM的组织特异性生物活性，并提供了能够引导和维持细胞行为的聚合物结构支持。它们还保留了与胶原蛋白等特定蛋白质相关的生物诱导、抗菌、化学吸引和免疫调节特性。此外，ECM水凝胶与ECM衍生的固体支架相比具有关键优势，包括其均匀浓度、通过微创手术（例如，通过针或导管作为预凝胶溶液注射）递送的能力，或其原位凝胶并符合实验室血管或不规则体腔的能力。

1998年，第一批ECM水凝胶来源于SIS。这些水凝胶和源自膀胱基质的水凝胶是表征和利用最充分的。然而，近年来，数十份科学报告描述了ECM水凝胶在几乎每个器官系统中的应用。事实上，这些材料在临床前应用中可用于治疗创伤性脑损伤、溃疡性结肠炎和中风。因此，它们在生殖系统中的应用可能并不令人惊讶，但却带来了令人兴奋的机会。

2.2.如何从ECM制备水凝胶？

ECM水凝胶的形成涉及将磨碎的脱细胞ECM材料溶解成单体蛋白质组分（也称为消化），然后进行pH和/或温度控制的中和，并诱导单体组分的再聚集（图1A）。通过胃蛋白酶在盐酸或乙酸溶液中的酶促作用溶解粉状ECM是形成“ECM预凝胶”溶液的最常用方法。根据临床应用，使用24-96小时的时间获得溶液；然后，液体在生理pH值和生理盐水浓度下被中和，当温度升高到生理值时，获得完全功能的“ECM水凝胶”（37℃） 。

ECM组分的溶解也可以通过使用研钵和杵或高速剪切混合器在高盐缓冲液中的物理均化过程进行。这种物理处理可以在使用分散酶的酶消化步骤之前进行，然后通常是使用尿素的一个或多个提取步骤。

2.2.1.ECM水凝胶聚合：pH、温度和交联方法的作用

由于天然胶原蛋白是ECM水凝胶的主要成分，ECM和纯化胶原蛋白溶液的聚合动力学具有共同的特点。胶原蛋白的凝胶特性已经很好地描述了，但其他生物分子和ECM水凝胶的存在可以提供独特的粘弹性特性。原纤维胶原聚合可通过pH或温度的变化诱导，这一事实使ECM水凝胶比其他天然或合成水凝胶具有显著优势。这一方面使其成为体内使用的理想候选药物，因为一旦给药，它们就会在原位凝胶。有趣的是，这种与温度相关的过程是可逆的。

ECM水凝胶的形成、预成型毒性或辐照风险不需要外源交联剂。然而，已经开发了各种交联技术来提高其机械特性。他们的目的是通过形成共价键来稳定胶原的聚合结构，保持其天然的完整性和构象。该过程基于反应性基团的共轭，例如羧酸盐(─COO─) 和胺(─NH2）与活性交联剂（例如戊二醛或gepinin）的胶原分子的结合。交联提高了水凝胶的机械特性，增强了其对化学和酶降解的抵抗力。这一步骤还降低了它们的免疫原性并对水凝胶进行消毒。

2.2.2.天然组织的重要性

每个组织和器官的细胞分泌的ECM具有独特且不断变化的组成，对细胞形态发生、分化和稳态具有关键作用。因此，组织/器官特异性ECM衍生材料具有生物分子的可变混合物，已证明对材料的机械和生物化学 特性具有影响。这提供了一个与ECM的本地起源相关的独特环境。就水凝胶而言，这不仅对其组成和潜在机制有直接影响，而且对其凝胶化、粘度或降解特性也有直接影响。这些变量的广泛表征以及生物相容性评估对于支持ECM水凝胶的使用是必要的。

2.3.ECM水凝胶表征

2.3.1.生物相容性

同种异体和异种抗原被免疫活性宿主识别为外来抗原，可诱导促炎反应，导致组织排斥。ECM衍生物的主要优点之一是ECM组分的高度物种保护，使其即使是异种受体也能耐受。在大多数情况下，首先在体外评估ECM支架和水凝胶的生物相容性（图1B）。体外试验可以评估特定水凝胶微环境中的细胞存活、增殖和分化以及水凝胶降解率。再细胞化测定、培养基补充、细胞封装和涂层是评估水凝胶生物相容性的常用策略。随后，可以在动物模型中评估其免疫调节能力（例如，通过皮下注射）。在这些试验中，评估免疫细胞向异种移植物的浸润是有用的。高炎症反应可能表明排斥反应，但ECM水凝胶也被发现促进调节巨噬细胞激活状态，这与体内重塑相关。如果ECM产品的安全性被公共卫生管理部门证明并接受，临床试验可用于深入评估其在人类中的治疗潜力。

2.3.2生化成分

ECM由结构和功能生物分子的复杂混合物组成，如果使用适当的方法，这些分子在脱细胞和增溶后大部分可以保留。统称为“基质”，细胞外环境的蛋白质包括胶原蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、分泌因子、ECM调节器和ECM相关蛋白。质谱是生物化学表征ECM水凝胶的最广泛的技术之一（图1B）。具体而言，反相高效液相色谱结合串联质谱（RPLC-MS/MS）支持测定ECM水凝胶的蛋白质组分布。研究ECM水凝胶组成的其他方法包括免疫组织化学技术、DNA和比色定量测试或ELISA测定。

2.3.3.凝胶动力学、机械特性和超微结构

ECM水凝胶的生物活性和生物相容性不仅决定了其用途。它们的粘弹性和机械 特性也影响其体内（注射性、吸收、原位凝胶化）和体外（硬度相关的细胞活力、增殖和分化）行为。一般来说，ECM水凝胶是热敏粘弹性材料，在低温下表现出类似于粘性液体的机械特性，在生理温度（37℃）下表现出介于固体和液体之间的机械特性。ECM水凝胶或预凝胶溶液的凝胶化动力学和粘弹性响应可通过流变学、压痕、纹理分析或浊度法测量。

固体ECM支架转化为ECM水凝胶导致天然3D构象的丧失。然而，水凝胶的复杂纤维网络保留了通过接触引导和与膜整合素受体相互作用的纤维结合蛋白来引导和允许特定细胞行为的能力。纤维直径、孔径和纤维取向是该相互作用事件中的关键变量。扫描电子显微镜（SEM）被认为是可视化水凝胶拓扑结构和分析其超微结构特性的最合适的技术，但透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和共焦显微镜也适用。

2.4.进一步：混合水凝胶

最近的研究将ECM水凝胶与其他天然或合成水凝胶结合，以提高其机械特性和生物活性。例如，据报道，肝源性ECM:胶原蛋白、ECM:透明质酸（HA）或ECM:肝素结合的HA混合水凝胶用于3D体外维持肝细胞功能。其他方法利用颗粒形式的ECM材料作为合成水凝胶的添加剂或将ECM水凝胶用作固体生物材料的涂层。

图1 生成和表征ECM水凝胶的示意图。（A） ：天然ECM的脱细胞、溶解和凝胶化程序。（B） ：ECM水凝胶的生物、生化和物理力学特性的主要技术。AFM：原子力显微镜；ECM：细胞外基质；ELISA：酶联免疫吸附试验；LC-MS/MS：液相色谱-串联质谱法；SEM：扫描电子显微镜；TEM：透射电子显微镜。

3.从生殖器官获得ECM水凝胶

从雌性生殖器官脱细胞获得的ECM产品在生殖医学领域具有突出作用，研究主要集中于源自子宫、卵巢、宫颈、阴道和胎盘的ECM产品。用于脱细胞的可变方法取决于组织类型及其特征。组织碎片浸泡和全器官灌注在生殖领域应用最广泛。ECM支架表征比去细胞化更标准化，使用了常用的组织学、免疫组织化学和电子显微镜技术。

最近的工作将来自生殖器官的脱细胞支架转化为ECM水凝胶，如第2.1节所述，其主要优点是能够符合任何缺陷部位的形状，因为它们首先作为粘性流体（预凝胶）注射，最后在生理温度下聚合成3D结构（水凝胶）。来自女性生殖道的ECM水凝胶的开发尚处于初期阶段，但有希望的结果包括从脱细胞子宫、卵巢、输卵管、阴道和胎盘形成水凝胶。

3.1.子宫内膜水凝胶

在大多数哺乳动物中，子宫是女性生殖系统中最大的器官，负责支持怀孕。它由子宫内膜、子宫肌层和子宫内膜三个解剖层组成，但由于其在妇科病理学和胚胎植入中的意义和重要性，生物工程方法特别关注子宫内膜层。

大量研究已分离出完整的小鼠子宫ECM，这是因为它们的高可用性、小尺寸和适用于随后的体内大鼠和小鼠模型研究。然而，一些研究小组已经与兔子、绵羊或猪等高等哺乳动物合作，试图以更像人类的大小来微调子宫的去细胞化。值得注意的是，具有不同和特定成分和功能的子宫组织（子宫肌层和子宫内膜）的分离和脱细胞已经在大鼠、兔子和人类中应用。实际上，子宫ECM水凝胶通常通过子宫内膜脱细胞（EndoECM）获得。

全子宫灌注是产生子宫内膜ECM最常用的脱细胞程序。子宫动脉的大尺寸有助于它们的管道化和与蠕动泵的连接，蠕动泵负责将洗涤剂和酶制剂推入器官。一旦子宫脱细胞，脱细胞子宫内膜可以被机械分离。其他方法，如浸泡和搅拌，需要在脱细胞之前切割不易区分的子宫内膜。这需要高度的专业知识。

2019年，Campo等人首次描述了从脱细胞兔子宫内膜中分离ECM水凝胶。为了实现这一点，通过立体显微镜下的显微解剖分离脱细胞子宫内膜，冻干并研磨。然后，通过Freytes方案的修改版本将该粉末溶解。在广泛表征之后，水凝胶被用于创建胚胎培养的生物表面涂层。有趣的是，功能化培养板影响了早期胚胎发育，表明ECM水凝胶含有组织特异性蛋白质，可以积极影响细胞培养。这一事实在动态组织中尤其相关，例如人类子宫内膜，其在增殖和分泌阶段经历了主要的周期性变化。

后来， López-Martínez等人使用猪子宫复制了这些去细胞和增溶方法。在一项初步研究中，使用EndoECM水凝胶在2D和3D条件下培养不同类型的子宫内膜细胞。随后，开发了由上皮细胞和基质细胞制成的3D子宫内膜样共培养系统。此外，EndoECM的体内生物相容性在皮下小鼠模型中得到了证明。基于这些结果，该小组后来将EndoECM水凝胶注射到子宫内膜损伤的小鼠模型中。他们的目的是将这些水凝胶用作生长因子（GF）载体，因为水凝胶能够结合生物分子并逐渐释放它们，延长GF寿命并增强GF作用。

最后，Francés-Herrero等人使用从猪子宫中以未聚合形式获得的EndoECM水凝胶来补充人类子宫内膜类器官培养基，拓宽了这种生物材料的可能用途和应用范围。

3.2.卵巢水凝胶

卵巢是女性的性腺，在女性生殖系统中扮演着两个重要角色：它们产生性激素雌激素和孕激素来调节月经周期，并负责卵母细胞的生长和成熟。只有两项研究开发了卵巢ECM（OvaECM）水凝胶。Buckenmeyer等人将其用作卵巢早衰（POF）小鼠模型中的卵泡载体，Chiti等人创建了一种基于OvaECM水凝胶的支持物，用于体外人和小鼠卵泡生长。

鉴于其系统发育的接近性，猪和牛的卵巢碎片或整个卵巢是最常用的脱细胞技术。这些物种的卵巢ECM与人类相比具有高度的蛋白质保护。此外，卵巢具有类似人类的大小和解剖结构，在奶牛的情况下，具有类似的单排卵动力学。然而，几个小组已经在体外和体内的同种异体和异种研究中开发了人卵巢ECM的潜力。

浸泡和搅拌整个器官或小组织碎片是卵巢脱细胞生成OvaECM水凝胶的最合适方案。与其单独使用酶制剂，不如将这些制剂和洗涤剂结合使用，因为洗涤剂可以有效地破坏细胞核和细胞膜，从而促进更好的脱细胞。整个卵巢的灌注是一个非常缓慢的过程，需要大量的清洁剂，因为被插管的血管解剖结构复杂。灌注和浸泡对卵巢脱细胞同样有效，因此，由于手术容易，优选后者。

3.3.输卵管水凝胶

输卵管是连接卵巢和子宫的解剖结构，在生殖过程中起着关键作用。受精发生在这些肌肉管中，一旦胚胎发育开始，它们就会产生收缩，将胚胎输送到子宫。因此，输卵管ECM（OviECM）水凝胶是研究早期胚胎发育的有吸引力的潜在工具。

2021，Francés-Herrero等人合成了兔OviECM水凝胶，这是该领域迄今为止唯一的一种水凝胶。通过浸泡和搅拌小输卵管碎片进行脱细胞，并使用改良版的Freytes方案溶解冻干输卵管基质。然后，作者通过在4℃下将孔的底部暴露于OviECM预凝胶溶液过夜并用磷酸盐缓冲盐水洗涤，在培养板上产生涂层。奇怪的是，目前还没有发表获得完整OviECM支架的特定脱细胞方案。通过灌注完全脱细胞后将输卵管与子宫ECM支架分离可能是获得完全脱细胞输卵管支架的最有效方法。

3.4.阴道水凝胶

阴道是一个纤维肌肉弹性管状管道，它将子宫和宫颈连接到体外，允许月经、性交和分娩。由于先天或后天因素，该器官的缺失会导致患者身心痛苦，并阻碍正常的性和生殖过程。

由于生物工程技术，存在用于阴道重建的ECM产品，如阴道ECM支架和水凝胶。对于阴道ECM脱细胞，几位作者使用了化学和酶制剂浸泡方案。然而，预先（手动）去除粘膜和/或肌层对于更好地渗透化学物质非常重要。在迄今为止进行的研究中，由于猪的系统发育接近、容易获得原料以及其类似的雌性解剖结构，猪是最优秀的动物物种。

Hou等人使用一种独特的策略，使用无细胞阴道基质生物墨水创建仿生3D阴道组织。为此，将脱细胞的阴道ECM冻干并溶解，得到阴道ECM预凝胶。这种预凝胶形式通过添加明胶和海藻酸钠转化为生物墨水，然后用于打印3D阴道支架。此外，作者通过体外封装骨髓间充质干细胞（BMSCs）证明了这些结构的可行性。BMSCs在3D支架内的存活率很高，这表明支架可以向细胞提供无限的营养和氧气，这使得体外长期培养成为可能。体内生物相容性测试使用3D支架封装的骨髓间充质干细胞移植到大鼠体内，结果为阳性。

3.5.胎盘水凝胶

胎盘是一个临时的器官，它允许母亲和胎儿之间的沟通，将氧气和营养物质从母体转移到母体，并允许胎儿释放二氧化碳和废物。它含有多种生理活性成分，如细胞因子、GFs和氨基酸，在胎儿-母体耐受性中发挥独特作用，防止胎儿“同种异体移植”被排斥。因此，羊膜来源的材料可用于减少同种异体移植过程中的宿主免疫反应。使用这种人类来源的组织可以大大减少异种支架的需求。

由于获取材料具有挑战性（即，需要尸体或疾病相关的切除术），目前尚无报道描述从人类子宫、卵巢或输卵管中开发ECM水凝胶的尝试。然而，产后胎盘材料的丢弃使人胎盘ECM水凝胶得以开发。

奇怪的是，胎盘ECM水凝胶尚未应用于修复或再生女性生殖道器官，但已用于其他系统的器官和组织。有两个独立的小组通过将磨碎的或整个器官浸泡在洗涤剂溶液中，然后进行消化和中和，制备了人胎盘ECM水凝胶。这些水凝胶可以在体外有效地支持心肌细胞，当注射到缺血心肌中时，它们在体内减少瘢痕形成，同时保持电生理活性。水凝胶还恢复了体内和体外毛乳头细胞的毛发诱导特性。

从新鲜胎盘上机械剥离羊膜，然后进一步脱细胞是获得胎盘衍生ECM水凝胶的另一种策略。Ryzhuk等人产生了一种人羊膜ECM水凝胶，并表明它可以被各种类型的干细胞重新细胞化。因此，羊膜ECM水凝胶由于其血管生成性质、生物相容性和通过自然过程生物降解的能力，是用于组织修复和再生的有前途的材料。

4.使用ECM水凝胶生物工程生殖道的当前方法

鉴于组织特异性ECM水凝胶提供强大的微环境，将其应用于体外平台或体内模型的开发被认为是生物工程和生物医学融合的最先进技术。然而，迄今为止，很少有团体在生殖领域使用它们，尽管文献中描述了源自生殖组织的ECM水凝胶。图2显示了在动物模型中或使用ECM水凝胶的动物或人类成分的所有应用的最新列表。

图2 脱细胞ECM水凝胶在女性生殖道中的应用。在左侧，体外平台涉及来自输卵管、卵巢和子宫的ECM水凝胶。右边是应用ECM水凝胶的体内模型

4.1.下一代体外平台的开发

4.1.1.涂层和2D细胞培养

在细胞培养中，培养板涂层增强细胞附着、迁移和功能。富含ECM成分、GFs和其他分子的组织特异性涂层改善了这些特征。因此，子宫内膜ECM（EndoECM）水凝胶作为子宫内膜细胞的2D培养涂层值得研究。首先， López Martínez等人生产了一种猪EndoECM水凝胶，该水凝胶能够用作培养人子宫内膜细胞的涂层，包括原代基质和上皮细胞或基质和上皮干细胞系。EndoECM还用作培养2.5 D结构中这些细胞类型的饲养器，并与胶原蛋白涂层或合成ECM水凝胶Matrigel®进行比较，后者因其致瘤性和不明确的化学特性而无法用于临床常规。通过四氮唑或活/死测定获得的细胞活力测量显示各组之间没有差异，但Ki67免疫染色的增殖分析显示EndoECM中的细胞增殖增加。为了测试EndoECM水凝胶的生物相容性和体内潜力，作者将水凝胶注射到免疫活性小鼠体内。他们证明其EndoECM含有少量潜在免疫反应分子，因此体内免疫原性低。这项研究证明，EndoECM水凝胶可以改善细胞增殖，将其定位为常规细胞培养方案中使用的替代涂层，以及体内应用的合适候选者。

由大鼠生产的EndoECM水凝胶也显示出一些成功。Vutipongaton等人在大鼠EndoECM水凝胶中培养大鼠子宫内膜基质细胞，并在两天、四天和七天通过活/死测定来测量其生存能力。他们发现，他们的EndoECM可以宿主活细胞，这与López Martínez等人的研究一致。

Campo及其同事是应用组织特异性ECM水凝胶作为培养胚胎涂层的创新者。他们研究了两种Rabbitorin的EndoECM水凝胶，测试子宫内膜脱细胞的周期阶段是否影响胚胎培养。为了实现这一点，他们获得了具有不增殖子宫内膜（NS）的非同步子宫内膜和GnRH激动剂（S）刺激卵巢后的同步子宫内膜。获得EndoECM并用于平板包衣，第三天在S、NS或Matrigel（M）上培养早期囊胚/晚期桑椹胚。用S水凝胶（而不是NS水凝胶）包衣产生了与Matrigel相似的孵化/孵化胚胎率，并且干细胞标记物（OCT4或SOX2）的表达模式相似。这项工作证明了在体外模拟子宫内膜环境以实现合适的胚胎发育的相关性，因为胚胎植入需要同步的子宫内膜。

OviECM提供了另一种材料来源，可用于在早期时间点为胚胎培养创建水凝胶，因为输卵管是受精的天然场所，也是植入前胚胎发育的地方。为了测试这一点，在兔OviECM涂层上或在标准培养基中培养两细胞兔胚胎。两组的胚胎具有相似的形态和发育动力学，即在可比的时间范围内（48小时）均达到桑椹胚晚期/囊胚早期阶段。对两个实验组进行了含或不含胚胎的培养基的代谢分析。在OviECM上培养的胚胎培养基的组成在培养期的开始和结束时相似。这与“安静胚胎假说”相吻合，该假说声称活的胚胎比不活的胚胎表现出“安静”的新陈代谢。他们的工作证实，水凝胶在其结构中保留生物活性ECM特异性蛋白质，并将其缓慢释放到细胞培养基中。

最近，Chiti等人设计了脱细胞OvaECM水凝胶，其能够支持人和小鼠卵巢卵泡的体外存活和生长，这也在卵巢ECM支架中进行了描述。即使OvaECM水凝胶提供比天然支架更合适的微环境，基于流变学特征，该水凝胶显示出比天然卵巢更低的刚性。因此，将OvaECM水凝胶与藻酸盐结合以获得混合水凝胶，这提供了必要的稠度，以允许卵泡扩张。为了确定藻酸盐的最佳浓度，作者分析了100%OvaECM、90%OvaECM–10%藻酸盐、75%OvaECM-25%藻酸盐和100%藻酸盐中的卵泡恢复率、存活率和生长。他们发现，增加藻酸盐浓度会导致卵泡恢复率成比例增加，但大多数情况下的卵泡存活率和直径相似。与其他组相比，只有100%OvaECM组没有出现卵泡恢复，并且在生存能力和卵泡直径方面存在差异。尽管显示出更好的结果，但由于纯藻酸盐的降解性低，移植后血管化较差，因此其不适合最终应用于卵巢。这项研究描述了合成材料的潜在用途，以创建具有适当刚度的混合水凝胶，以保持特定的3D结构并提高生物功能。

4.1.2. 3D培养物和类器官

二维培养物模拟自然微环境的能力有限，但3D培养物旨在模拟体内组织特异性条件刺激的相互作用、增殖和分化。为了克服这一问题，一些作者使用充满不同细胞类型的生殖ECM支架开发了3D结构，如子宫、卵巢、阴道或胎盘支架所报道的。然而，当前的3D培养条件通常缺乏细胞ECM相互作用，这对再现生理条件至关重要。López Martínez等人展示了他们的猪EndoECM细胞涂层作为子宫内膜原代细胞和干细胞的3D共培养（上皮和基质）系统的实施。他们将这种方法与标准培养条件进行了比较，10天后发现两组在细胞增殖方面没有差异。用EndoECM培养的细胞具有正常的表型，并表达子宫内膜细胞的典型标志物。此外，EndoECM组的细胞增殖性更强。EndoECM也随着时间的推移而重组，数量减少。这种现象发生在其他胶原基水凝胶中。

该EndoECM是第一个用作人类子宫内膜类器官培养的添加物。类器官是自组装的3D多细胞体外结构，比标准2D细胞培养物更好地模拟其起源器官。来源于人类子宫内膜活检的类器官在Matrigel中生长，并在四种不同的条件下培养：最佳标准培养基（ExM）、缺乏烟酰胺的次优培养基（ExM NA），以及 添加有0.1mg/mL EndoECM（ExM+EndoECM和ExM NA+EndoEM）的孕凝胶溶液的这些培养基。球体计数显示，EndoECM 添加物增强了ExM的增殖，并能够克服NA的缺乏。此外，基于标记物分析，EndoCM没有破坏类器官的腺上皮特征。类器官表达上皮标志物（细胞角蛋白），缺乏基质标志物（波形蛋白），保留祖细胞标志物（N-钙粘蛋白和SSEA-1）。此外，用EndoECM培养的细胞中没有长期染色体改变。总之，EndoECM 添加物为类器官发育提供了一个有希望的环境， 添加了ExM培养基和Matrigel的使用，这并不能完全概括体内动态环境。然而，本研究的一个局限性是EndoECM作为培养基的一部分，而不是Matrigel的替代品，因为它具有凝胶的能力。一项肠道类器官的研究确实发现，用其他胶原凝胶代替基质胶会刺激类器官在漂浮凝胶中自组织成厘米长的管。

4.2.体内应用：动物模型

4.2.1细胞移植载体

原位细胞输送可改善多种疾病的治疗。与直接给药细胞或在ECM支架中整合相比，使用水凝胶作为载体可以提高体内细胞保留和细胞植入的速率。Buckenmeyer为一种用于生物医学和生物技术应用的卵巢衍生水凝胶（OvaECM）申请了专利（US 2017/0252485 A1），并将其作为化疗诱导的POF小鼠模型中的卵泡输送系统实施。从小鼠供体获得卵泡，用GFP标记，与OvaECM混合，并小心地显微注射到受体雌性的卵巢中。注射后两周，这些小鼠通过三个繁殖周期与雄性小鼠交配。这些小鼠产生了健康的后代，证明了卵泡的适当植入。这种技术似乎是化疗后恢复卵巢储备的一种微创选择，似乎比使用卵巢皮质移植风险更小，尽管前景光明，但这可能会将恶性细胞引入体内。

4.2.2 补片

一些课题组使用生殖ECM支架作为贴片。然而，它们具有侵入性应用的缺点，并且它们与移植部位缺乏强烈的生化相互作用。相比之下，ECM水凝胶是一种微创系统，可通过注射器引入，并且符合缺陷部位的形状。此外，暴露于来自水凝胶的细胞因子、趋化因子、GFs、隐蔽肽、生物活性基序和生物活性基质结合纳米囊泡可影响周围细胞行为，因此，增强伤口愈合和细胞分化，即使ECM水凝胶的再生效应尚未完全了解[。因此，ECM水凝胶可以作为生殖道再生的补片。Duran等人申请了猪骨骼肌ECM水凝胶（SKM）的专利，以治疗盆底疾病（WO 2018/21375 A1）。该生物材料应用于模拟出生损伤（SBI）大鼠模型，以评估其作为促再生支架的功效。简言之，在诱导和验证SBI模型后，立即或在出生后四周注射SKM或生理盐水，后者的注射旨在模拟常规产后访视的时间。SKM注射后4周收获组织。与未经处理或注射盐水的SBI小鼠相比，注射水凝胶的SBI鼠胶原沉积显著减少，纤维面积增加，与未受伤大鼠相似。然而，血管化在治疗中没有显著变化。长期来看，SKM增强了肌肉恢复，甚至诱导了比未受伤对照组更大的纤维面积，并降低了纤维化反应。转录研究显示几种促炎基因的表达减少。因此，这项研究提出了一种用微创无细胞生物材料治疗SBI的新方法。

4.2.3.药品库

ECM水凝胶还提供了作为药物递送载体的可能性，因为其亲水性和高度多孔性能够适应物质的受控释放[129]。最近，López Martínez及其合作者将其猪EndoECM作为生长因子的载体，以恢复子宫内膜损伤的动物模型。用10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、100ng/mL血小板衍生生长因子BB和100ng/mL胰岛素样生长因子-1 添加物生物素标记的EndoECM，并将其再生效果与EndoECM单独和盐水阴性对照进行比较。在子宫内膜乙醇诱导损伤后四天进行治疗，两周后检查组织再生，并通过自然交配评估生育能力。与盐水组相比， 添加物EndoECM组的慢性炎症标志物（即胶原沉积）减少，腺体数量、子宫内膜面积、新生血管生成和细胞增殖增加。与此一致， 添加物EndoECM组产生的胚胎数量与未受损动物相似。这可能是由于ECM纤维能够携带和保持生物分子，例如GFs，并逐渐释放它们，从而延长其寿命并增强其作用。因此，这种水凝胶可以最佳地释放生物产物，从而刺激比单独EndoECM更好的组织再生。

4.3.非ECM水凝胶在人类生殖道中的应用ECM水凝胶的治疗应用仍然限于动物模型。

因此，在本节中，我们介绍了已经应用于女性生殖医学领域的主要天然、合成或混合非ECM水凝胶，这可能为基于ECM的转化铺平道路。胶原支架主要用于临床试验，以携带干细胞，例如脐带间充质干细胞（UCMSC），有效治疗薄子宫内膜或粘连的子宫内膜。为了构建UC-MSC/胶原复合物，两组均使用直径为20–200μm的4 cm×6 cm多孔胶原支架。细胞接种支架在移植前孵育一小时。Cao等人将复合体附着在子宫内膜壁上12小时，而Zhang等人将复合体放置三天。胶原也被用作碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的载体，这种治疗成功地修复了Asherman综合征患者的粘连。类似地，Jian等人使用胶原结合域在子宫内膜中逐渐释放bFGF。为了强调这一点，三组研究表明，他们的治疗显著改善了子宫内膜厚度，不同再生标记物（如Ki67、雌激素受体α或孕激素受体）的表达增加。更重要的是，接受治疗的妇女的活产率有所提高，这证明了胶原疗法治疗萎缩性子宫内膜的有效性。

基于胶原蛋白的载体也被用于治疗卵巢缺陷。Ding等人使用一种新型UC MSCs支架来激活POF患者的卵泡。简言之，他们将可降解胶原纤维与UC MSCs混合，并在经阴道超声检查下将其注入卵巢。作者描述了一些患者通过成熟卵泡的存在来恢复卵巢功能，最终使临床妊娠成功。

可喷洒的水凝胶对伤口表面表现出高粘附性，并且具有最小的侵袭性。在女性生殖道中，据报道，由合成聚乙二醇（PEG）衍生物制成的水凝胶或与右旋糖酐醛（ActamaxTM粘附屏障）以喷雾形式制成，以避免子宫肌瘤切除术后形成粘连。使用气体辅助系统将这些水凝胶喷洒到外科创伤和邻近结构中。它们都显著减少了子宫肌瘤切除术引起的粘连，并强调了产品的安全性。这些类型的水凝胶易于在腹腔镜或开放手术中应用，可以防止术后粘连。

5 未来展望

生物工程技术在生殖医学领域的应用并不新鲜。在体外、动物模型和临床试验中，已经使用了许多天然的人工合成和混合材料，无论是水凝胶还是固体支架。从生殖器官获得ECMs的脱细胞技术对推进这一领域越来越重要，而且多种方案支持女性生殖道几乎所有组织和器官的脱细胞发展。然而，在女性生殖医学中，以溶解和中和的形式使用这些基质仍处于初级阶段，几乎不存在用于治疗男性生殖缺陷。

大多数报告ECM水凝胶在生殖领域中使用的研究都是在体外环境中进行的。有证据表明，这些生物材料在培养表面的功能化或作为3D培养的基质方面具有潜力。这一领域的研究不仅可以改善当前妇科疾病的培养平台和体外模型，还可以代表辅助生殖诊所的范式转变。一些临床前研究表明，人类卵泡和胚胎的培养可能受益于这些生物材料。

正如在心脏病等临床领域或妇科疾病的小鼠模型中所证明的那样，ECM水凝胶可以扩大治疗POF、Asherman综合征或子宫内膜萎缩等疾病的原位治疗选择。使用水凝胶作为细胞、药物或其他生物衍生物的载体几乎是现实。此外，生殖医学的进步可以转移到其他临床领域，如胎盘ECM水凝胶的效用证明了这一点。

此外，胎盘ECM水凝胶的应用表明，生殖医学的进展可以转移到其他临床领域。最后，如Hou等人所证明的，ECM水凝胶在生殖医学领域的应用可以与其他生物工程技术相结合，例如微流体系统或3D生物打印（作为生物墨水），生成复杂的体外系统和可移植的3D构建体。

如果ECM水凝胶作为生殖医学和研究领域的参考生物材料得到巩固，那么大规模生产女性生殖器官的可用性可能是一个潜在的限制。然而，异种方法的使用将有助于原材料的采购，防止这成为ECM水凝胶的扩展和进一步开发的限制。此外，一些研究表明ECM基质在哺乳动物中几乎具有普遍的兼容性，成为这些生物材料的主要优势之一。

最后，请注意，随着生物工程技术的快速发展，预计ECM水凝胶将越来越精细，并适应不同应用的特定要求或需求。从这个意义上讲，纯化基质的某些组分，或用感兴趣的分子或因素富集水凝胶，将增强所需的性能。

6.结论

总之，生殖医学受益于天然和合成生物材料开发和应用的许多进展。由于寻求更好地模拟发生不同生理过程的天然微环境，人们对组织特异性脱细胞ECM越来越感兴趣。通过溶解组织特异性ECM而产生的水凝胶已经被开发、表征并广泛应用于几乎所有医学学科，但在人类生殖领域中仅被少量采用。有希望的体外研究和动物模型突出了这些水凝胶的潜力，但临床应用需要未来的研究。

参考文献：Francés-Herrero, E.; Rodríguez-Eguren, A.; Gómez-Álvarez, M.; de Miguel-Gómez, L.; Ferrero, H.; Cervelló, I. Future Challenges and Opportunities of Extracellular Matrix Hydrogels in Female Reproductive Medicine. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 3765. https://doi.org/10.3390/ijms23073765