小鼠子宫内膜上皮细胞的分离和培养
Q：按照一篇外文文献成功的提取过一次，但是后来再提 7.8 次重复都没成功，求助园子里的大神有没有提过小鼠子宫内膜上皮细胞的
A1：1)颈部脱臼法处死妊娠第 4 天(d4)的孕鼠，在无菌条件下摘取小鼠的子宫；
(2)在超净工作台上将子宫组织在无钙、镁的 0.01MPBS 中洗去血块和黏液，在低倍解剖镜下用眼科剪去除组织周围的脂肪块和血管；
(3)在解剖镜下沿子宫腔将其纵向切开，内膜面朝上展平于培养皿中。加入 1g/LⅠ型胶原酶消化液，37℃ 消化 30min，其间可振荡数次；
(4)消化结束后轻轻吹打组织块，挑出大块组织，按 10% 的浓度加入胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)或培养液终止消化，将消化后的细胞悬液经 150μm 筛网过滤，除去黏液和未消化的组织，将消化液转移至含 10mLPBS 的离心管中静置 10min；
(5)弃去上层液，下层液 500×g 离心 10min；离心结束后弃去上清液，而后血清培养液重新悬浮细胞，500×g 离心 10min。重复此操作清洗细胞2次；
(6)检查细胞悬液中细胞密度，并将其密度调整到 5×105 个细胞 /mL；(7)以 0.5mL/ 孔将细胞接种于 24 孔培养板中，置入 37℃、5%CO2 的培养箱中培养。
培养 4～5h 后细胞可以贴壁生长，24h 细胞即可生成单层，单层细胞排列紧密，呈长、圆或多角形生长。
A2：小鼠子宫内膜上皮细胞的分离和培养可以采用以下方法：
准备工具和试剂：含有 10％ 静脉血清（FBS）的 DMEM / F12 培养基，适当浓度的胰酶，PBS 等。
将小鼠宰杀，将子宫迅速取出，并在无菌环境下进行操作。
用 PBS 洗涤子宫，将子宫的肌层切除。
使用含胰酶的 DMEM / F12 培养基，将子宫组织分离并在 37°C 的孵化箱中消化约 30 分钟。
过滤细胞悬液并离心沉淀，用含有 10％ FBS 的 DMEM / F12 培养基重新悬浮细胞。
将细胞悬液转移到培养皿中，并放置在 37°C 的培养箱中。
24 小时后更换培养基，每两天更换一次，观察细胞生长和分裂情况。
需要注意的是，成功的分离和培养小鼠子宫内膜上皮细胞需要严格控制操作过程中的无菌和时间，胰酶的消化浓度和时间要根据实验情况调整，同时保证培养基的组成和 pH 值符合要求。
Q：每次小鼠眼球取血都会溶血，求帮助，到底什么样的操作可以做到不溶血
A1：注意你用到的采血针和装血的 ep 管，都用肝素润一下，再就是操作要轻柔
A2：具体步骤如下:
单手固定好小鼠；
必要时剪掉小鼠胡须，防止污染血液；
轻压取血侧眼部皮肤，使眼球充血突出；
用弯头镊夹取眼球并快速在摘取；
同时用左手中指轻按小鼠心脏部位，以加快心脏泵血速度；
当血液流尽时，用脱臼法处死小鼠；
注意事项：
固定小鼠很关键，若未固定好使小鼠头部摇动会损失很多宝贵的血液。
挤压心脏时，用力要适度，若用力过度不仅会造成动物中途死亡，使采血不完全，还可能引起溶血现象发生，影响实验结果。
采血的器材和试管必须保持清洁干燥。
采血前可以给小鼠喂点水。
血液凝固后不宜在四度放置过久，否则会溶血。
A3：小鼠眼球取血时可能会发生溶血，通常是由于取血时操作不当或使用不当的采血器具所致。以下是一些可能有助于避免小鼠眼球取血时发生溶血的建议：
确保采血器具的选择适合小鼠的年龄和大小。
注意使用正确的采血技巧，避免损伤血管或血细胞。
在取血前，将采血器具预先冲洗并预热至体温。
确保采血时的速度适中，不要过于迅速或过于缓慢。
在取血时，可以将小鼠固定在柔软的抱垫上，以避免运动和挣扎。
采血后，尽快将采集的样本放置在冰上，以尽快降低样本温度。
使用正确的抗凝剂，并按照说明书的指示加入正确的量。
请注意，以上建议仅供参考，不同的实验条件和操作方法可能需要不同的采血技巧。因此，建议在进行小鼠眼球取血时，先行做一些试验以确定最佳的操作方法。
Q：大家好，想请教些问题，要做小鼠脾脏取 T 细胞？需要买些什么材料？然后大家有什么成功率高的具体步骤吗？谢谢大家
A1：小鼠脾脏取 T 细胞步骤:
1. 小鼠颈椎脱臼处死，75% 乙醇浸泡 5 分钟，取出小鼠置于无菌操作台上，左腹侧朝上；
2. 在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；
3. 在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离下面的结缔组织，取出脾脏；放入盛有 5ml 不完全培养液的培养皿中冲洗，剥去周围的结缔组织。
4.A、梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降 5 分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；
B、钢网研磨法：脾脏放置不锈钢网（100 或 200 目）上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液；
C、酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入 400 u/ml 胶原酶（III型）5ml/ 只脾脏，37 度消化 20 分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
注意：1. 一般 6-8 周龄小鼠，根据品系不同，可得 5-20×107 细胞/只小鼠；2. 手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在 95% 酒精的小容器中，用前取出器械，酒精灯上烧灼去除酒精，可保证无菌。
从单细胞悬液中分离淋巴细胞：
1. 另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。用 1500 转/分钟，20 分钟。
2. 离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入 PBS 离心洗两遍（PBS1000 转/分钟，10 分钟）。
3. 洗好的细胞加入 1640 培养液和 ２０％ 的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放 37 度孵育一小时。一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我柱子是用大号注射器做的），以 HANKS 液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B 细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是 T 细胞，纯度可打到 80％ 到 90％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是 B 细胞。得到的细胞可以以 1640 加血清配制的培养液进一步培养或做它用。但淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好用磁珠或流式分离。
A2：使用组织研磨器或针头将脾脏碾碎成单细胞悬液。
将单细胞悬液通过离心等方式去除红细胞、血浆和血清等成分。
使用磁珠、细胞排序等技术分离 T 细胞。例如，可以使用特定抗体标记 T 细胞表面的 CD4 和 CD8 抗原，然后使用磁珠或细胞排序将这些T细胞分离出来。
检查提取到的细胞的纯度和活力，以确保它们适合后续的实验和应用。
需要注意的是，小鼠脾脏提取T细胞的具体步骤可能因实验目的和方法不同而略有区别。
Q：有没有大佬用同源重组法做基因敲除的时候遇到过载体转进去后面没有替换掉目的基因的。
A1：我也遇到过，而且发生几率还比较高，建议更换质粒类型或者重新转。
A2：毕竟是概率问题，题主用的是自杀质粒还是正常质粒？看看同源臂的长度和设计有没有什么问题，都没问题就多做看运气了，有些宿主确实不好敲
A3：同源重组法做基因敲除时，遇到载体没有替换掉目的基因的情况是比较常见的。
一个可能的原因是载体和目的基因之间没有足够的同源性。在这种情况下，重组可能发生在目的基因外的其他地方，不能造成敲除。
另一个可能的原因是载体转换率太低，没有足够的载体进入细胞并进行重组。
如果遇到这样的情况，可以考虑以下方法：
增加同源性：通过增加同源性来增加重组的概率。
增加转换率：通过增加载体转换率来增加重组的概率。
改变重组方法：使用其他重组方法来实现敲除。例如，CRISPR-Cas9 系统是一种高效的基因敲除方法。
希望这些建议对你有所帮助。
Q：小鼠如何经皮颈动脉取动脉血
A1：先将小鼠仰位固定，切开颈部皮肤，在气管两侧分离出颈动脉，远心端结扎，将针头朝近心端刺入，动脉血压力大，只需轻轻抽吸。
A2：颈动脉取血：将麻醉的小鼠或大鼠仰卧位固定于鼠板上，作颈动脉或颈静脉分离手术，当动脉、静脉暴露后，血管下各穿一根丝线，提起血管，将注射针沿血管平行方向朝向心端刺入血管抽取所需血量。小鼠 20g 体重可取血 0.6ml 左右。
A3：经皮颈动脉取动脉血是一种常用于实验动物（如小鼠）的血液采样方法。以下是取血的步骤：
准备：将小鼠固定在操作台上，使其不动。将小鼠的头部向上，使颈部暴露出来。
定位：找到小鼠颈部的颈动脉，通常在颈部前方 1-2 毫米处。
消毒：使用 70% 酒精消毒取血部位。
取血：使用 26G-30G 的采血针，轻轻地插入颈动脉内，使血液流入采血管中。采取适量血液，以避免损伤动脉，不影响动物的生存和健康。
停止采血：当血液流出速度慢时，缓慢地拔出采血针。
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最后编辑于 2023-02-15 · 浏览 1941
