小鼠脑脊液CSF提取步骤

小鼠脑脊液提取物品准备：玻璃毛细管、微管拉拔器、显微操作器、毛细管支架、解剖显微镜、直钳、细管、三通阀、注射器、4%三氯乙醛（据情况调整）解剖剪、小鼠头部固定器、剪刀、弯镊、棉签、无菌生理盐水、含1 μL 20x蛋白酶抑制剂的1.5 mL微管、离心机，三角针、镊子、碘伏。

二、操作步骤

（1）收集脑脊液（CSF）前准备：

1.使用微管拉拔器拉动玻璃毛细管。将磨尖的玻璃毛细管安装在显微操作器上的毛细管支架中。在解剖显微镜下，用直钳将磨尖的毛细血管尖端折断，使其尖端内径约为10-20 μm。

2.将细管连接到毛细管支架的另一端，用三通阀将细管和注射器连接起来。 将三通阀打开，拔出注射器吸满空气，在连接到三通阀，快速推注射器，将注射器内的空气通过管道吹向玻璃毛细管，排出污染物，使毛细管内产生正压，重复3-5次（a few times）。吸取100-200ul空气，重新将注射器与三通阀连接。

3.将显微操作器与玻璃毛细管移向一边，避免在小鼠解剖过程中接触损坏。

（2）小脑延髓池/枕大池暴露手术1. 麻醉：配备4%的三氯乙醛10ml，按400mg/kg剂量麻醉，小鼠称重后腹腔注射麻醉剂，轻微伸展后肢并夹捏四肢脚趾观察缩趾反应，若反应基本消失，说明麻醉程度适宜。

2.脱毛固定：用解剖剪剪去头后部毛发（从眼睛上方、经两耳之间到脖子底部。)使用（小鼠头部固定器）固定鼠头部,将耳条固定于鼠的耳朵和眼睛之间并拧紧,头后部朝上，鼻子朝下约45°,轻轻按压鼠头，确保固定牢靠。

3.皮肤消毒

4.用剪刀和弯镊将老鼠的皮肤切开（从脖子后面，沿着耳朵和眼睛间的头骨中线切开）。将皮肤和第一层肌肉剪开并拉向两边使其远离枕大池区域，可看见颅骨外仅有一层薄薄的肌肉。 在解剖显微镜下，小心地将颅骨外最后一层薄薄的肌肉剥离移向侧边，暴露硬脑膜。如有出血，用棉签止血。之后用湿棉签将膜擦拭干净，然后用干棉签干燥该区域(呈三角形，通常有1-2条大血管穿过;血管两侧或血管之间是毛细管插入收集脑脊液的最佳位置）。

三、脑脊液的采集

1. 将玻璃毛细管对准鼠头后部，使尖端以30-45角倾斜，靠近膜表面。

2. 注射器抽吸几次后，吸取100-200 μL空气(确保玻璃毛细管内无污染物和负压)。

3.使用显微操作器，将毛细管尖端靠近硬脑膜，直至感受到阻力，但不要刺穿膜。

4.通过敲击微操作器控制装置，轻敲毛细管使其穿过硬脑膜。脑脊液自动被吸入毛细管。

5. 让毛细血管慢慢收集脑脊液。脑脊液(毛细管中~ 3 ~ 4cm)吸取量为 10-15 μL，用时10- 30min。若脑脊液停止流出，则注射器缓慢向上抽出约50μL。{另外，也可以使用显微操作器控制将毛细血管缓慢地拉出大脑，使脑脊液再次流入毛细血管。

6. 收集到所需的CSF量后，关闭三通阀停止抽取CSF。

7. 取出注射器，打开再关闭三通阀(使毛细管、塑料管和毛细管外区域的压力平衡)。将注射器重新插入。

8. 使用显微操作器轻轻地抽出玻璃毛细血管。

9. 将收集管(含1 μL 20x蛋白酶抑制剂的1.5 mL微管)置于玻璃毛细管尖端下。

10. 打开三通阀，轻推注射器使脑脊液流入收集管。

11. 收集后，快速离心CSF（用迷你离心机以最大速度离心5秒，使样品与收集管底部的蛋白酶抑制剂混合）。注:CSF样品可在-80°C下保存以作进一步分析。

四、缝合消毒

1.缝合：对齐皮肤，左手持镊提起皮肤，右手拿持针器用三角针缝合，间断缝合两针。

2.碘伏消毒后，将小鼠放回笼盒，呈仰卧位或侧卧位。将鼠笼放置于复温袋上，待苏醒后返回动物房。

3.清理桌面和器械。

主要参考文献：

1.An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice.

2.A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse.

两篇文献在jove上均有视频。

（文章系个人整理用于笔记分享，欢迎提出改进建议和交流）