小鼠附睾尾（Cauda）取精实验

一、背景知识介绍

1.1 精子在附睾成熟

精子在附睾运输过程中获得其受精能力和向前运动特性，通过境附睾的雄性配子所经历的这些修饰被称为精子成熟。附睾是分泌能力最强的器官之一，精子通过附睾时能够获得许多由附睾分泌的物质（蛋白、RNA、DNA等），这些物质主要由附睾小体（epididymosome）负载，然后结合到精子的头部（绝大部分）和中段，这些物质在后期的精卵结合以及雌性生殖道的适应过程中起着重要作用。其他功能归因于附睾，例如精子浓度和运输，雄性配子的免疫保护及其作为精子库的作用。人类中的血管传出不是连接睾丸和附睾小管的直小管。一些传出管是盘绕的，一些是分支的，而另一些是无穷无尽的，不与附睾小管融合。

图1 小鼠睾丸-附睾解剖图

（Cited：doi: 10.1186/s12894-017-0215-5）

（图2 小鼠精子发育）

小鼠睾丸从精原细胞到圆形精子需要天，到长型精子需要35天，在附睾中存储约15天。

1.2 附睾对来自睾丸精子水分吸收（浓缩精子）

从对啮齿动物物种的研究中，我们了解到输出管（efferent duct）对水的重吸收与肾脏一样有效，主要发生在附睾的起始段（initial segment，IS）。参与水重吸收的Na / H/ATP酶的表达是雌激素依赖性的，并且在血管传出中很高；其表达沿附睾延展逐步减少。事实上，据报道，起始段附睾中的雌激素浓度非常高。雌激素在传出管功能中的作用可以通过性雌激素受体敲除小鼠很好地说明。在该模型中，由于与血管传出无法重吸收腔内水相关的水积聚，睾丸体积显着增加。一些可能参与水转运的离子转运相关蛋白已经沿着传出管和近端人附睾进行了免疫检测。可能参与水运动的这些蛋白质的细胞表达和组织分布显示出人类和动物模型之间的差异，表明人类男性生殖道中存在功能特异性。人附睾在水重吸收中的作用仍有待澄清。

1.3 附睾解剖图

小鼠和大鼠的附睾已根据结缔组织隔的存在分别细分为10和19个区域内节段。简单的科研分为初始端（initial segment），头（caput），体（corpus），尾（cauda）。后者将附睾分成不透水的子区室，如在给定节段的管间空间中注射的高分子量染料无法扩散到相邻空间所示。在实验室动物中，通过结缔组织隔膜分隔附睾间质可能限制旁分泌因子对特定附睾节段的影响。迄今为止，没有实验证据支持这一假设。在实验动物中，已知初始片段（initial segment）是更活跃的附睾片段，并在精子成熟中起主要作用。原癌基因c-ros的表达与小鼠的初始节段分化有关，因为它仅在分化的附睾的这一节段表达。c-ros敲除小鼠中c-ros表达的丧失与缺乏分化的初始节段导致男性不育有关。

（图3 附睾各分段示意图）

附睾的解剖结构。小鼠（A）和大鼠（B）附睾的示意图，说明通过结缔组织隔膜分割附睾间质。（C）大鼠附睾近端区域纵向组织学切片的显微照片。根据（B）绘制结缔组织隔。（D）从睾丸中解剖的人类附睾的照片。（cited：The human epididymis: its function in sperm maturation）。

1.4 附睾蛋白组、转录组，胞外囊泡（extracelluar vesicles, EVs）组学

精子是一种高度极化的细胞，在精子发生过程中消除了大部分细胞质和细胞器。已知该细胞在转录和翻译上是沉默的。完整的射精，精子以及分离的亚细胞区室（如头部，尾部，细胞核和膜）已经过蛋白质组学分析。在人类精子裂解蛋白组中已经鉴定出超过5000种蛋白质。附睾腔内隔室的蛋白质组成沿着附睾变化，并且每个片段都有自己的蛋白质组和分泌组特征。在附睾液中已经鉴定出数百种蛋白质，并且一些物种差异是显而易见的。在所有优生物种中，<20蛋白占附睾腔内蛋白总含量的80-90%，包括簇蛋白，前列腺素D合酶，谷胱甘肽S-转移酶，脂质链酶5和Niemann-Pick C2型疾病蛋白。根据Dacheux等人的说法，白蛋白几乎占人附睾液总蛋白质含量的50%。

（图4 人类附睾组学分析）

（Cited：The human epididymis: its function in sperm maturation）

1.5 附睾功能总结

在啮齿动物中，近端附睾（IS和caput）是对控制下游基因表达而提出的腔内因子反应最灵敏的片段。因此，附睾在以片段特异性转录组特征为特征的基因表达中非常活跃。在这些物种中，隔膜沿着附睾定义了不同的隔室。据推测，这些结构也参与基因表达的调节。毫无疑问，当考虑到没有初始节段，由传出管形成的近端帽以及存在定义不明确和不完整的隔膜时，人类附睾的解剖结构是特殊的，这些隔膜不能清楚地标记附睾隔室。这些观察提出了关于该器官在人类中的功能意义的问题。快速的精子运输，附睾小管相对较小的直径和分化不良的尾段也给人的印象是附睾对人类精子成熟可能不如实验室动物所示那么重要。相比之下，转录组学和蛋白质组学研究告诉我们，基因表达的模式沿着人附睾变化，而caput片段具有最高的转录组学活性。结合有关正常男性附睾生理学的现有信息，这些观察结果支持了人类附睾精子成熟的概念。

人类的附睾是“可塑的”，正如输精管切除术对附睾转录组（特别是在IS）的影响所显示的那样。我们对附睾精子参数的几乎所有知识都是基于在附睾阻塞和发育不全的情况下沿男性束收集的精子细胞。如果输精管切除术后附睾中存在的精子与阻塞器官中收集的精子相当，则关于人附睾功能的结论可能会被扭曲。应该记住，仅经历部分附睾凌运的精子受精能力有限，并且必须应用ART（例如ICSI）来产生具有这些雄性配子的受精卵。

二 小鼠附睾尾取精实操

2.1 器材准备

解剖器材、75%酒精、解剖镜、胚胎培养液、精子保存液（可购买/或者自行配制）。

2.2 操作步骤

（1）将小鼠麻醉后，断颈处死；

（2）将小鼠腹部使用75%酒精擦拭3遍；

（3）腹部横向剪开一个小口子，然后将小鼠腹部被皮扯开；

（4）将小鼠腹腔膜发开，可将小鼠睾丸组织；

（5）根据睾丸定位附睾，找到附睾，并将这个附睾剥离（务必小心获得完整的附睾）；

（6）将剥离的附睾转移至PBS液体中；

（7）将小鼠附睾尾剥离，并转移至精子保存液中；

（8）将附睾尾用眼科钳剪碎，然后放置在37℃水浴锅中，作用10分钟作用；

（9）水浴完成以后，可吸取部分液体进行精子图片并镜检（一般使用CASA），可见从附睾尾游出来大量的精子；

（10）根据实验需求（精卵结合/精子运动力/畸形率/总蛋白/DNA/完整性/抗氧化活性等），处理从附睾尾获得的精子。

（理论+实践展示，附睾这部分这是我的强项，嘿嘿，有什么不懂的或者我讲的不恰当的地方请留言，我们一起完善！！1）