实验记录｜细胞培养、传代、冻存、铺板

细胞培养：

一、原理：细胞培养是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使细胞生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。通过细胞培养，来获得大量细胞，并可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增值、药敏试验、细胞分化等。

二、细胞培养：将取得的组织细胞/细胞系接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。以系细胞培养为例，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数（后边会记录具体计算方法），按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基，（接种细胞数量因培养皿而异，如下图）。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。

三、步骤：当培养皿中细胞数量达80%-90%时，为了使细胞继续增长，同时扩大细胞数量以及保存细胞（特别是不易获得的突变型细胞或细胞株），因此要进行细胞传代及细胞冻存。

在此以贴壁细胞为例：（细胞传代、冻存、铺板前边步骤基本一样）

1.弃去培养皿中原有培养基，并用PBS清洗2-3遍；

2.加入适量胰酶消化，根据细胞种类不同，选择不同消化时间，一般消化2-3分钟；

3.充分拍打使细胞尽可能脱壁，显微镜下观察细胞变为圆形、透亮，加入等体积的培养基终止消化，用移液枪充分吹打细胞，使细胞充分混悬；

4.将混悬细胞转入离心管中，1200rpm 4℃ 离心5min（离心速度、温度、时间根据细胞不同有所差异）；

5.离心后倒掉上清液，加入适量培养基重新混悬细胞；

这一步之后就可以开始传代、铺板、冻存等操作啦。

A.细胞传代：将上述混悬液根据需要分装至新的培养皿中继续培养，用8字或者十字摇匀法使细胞平铺均匀，并在显微镜下观察细胞数目、密度、状态等，放入37℃ 5%CO2 80%湿度的恒温箱培养。

B.细胞冻存：冻存液配置：70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO,上述细胞离心后倒掉上清液，加入适量冻存液充分混匀，分装至冻存管中，－80℃冰箱保存，原则：慢冻快溶。

C.细胞复苏：

C1：将冻存细胞从－80℃冰箱或液氮罐中取出，立即放入37℃恒温水浴锅中（也可以用手摩擦）化冻，原则：慢冻快溶。

C2：在室温下放入离心机：1200rpm 4℃ 5min离心（离心速度、温度、时间根据细胞不同有所差异），并弃去上清液；

C3:加入适量新鲜培养基充分吹打混匀，将混悬液根据需要分装至新的培养皿中继续培养，用8字或者十字摇匀法使细胞平铺均匀，并在显微镜下观察细胞数目、密度、状态等，放入37℃ 5%CO2 80%湿度的恒温箱培养。

四、注意事项：

1. 无菌原则：操作前将需要用到的物品以及超净工作台提前用紫外线照射30min，操作过程中拿放物品时勤用酒精消毒手及物品，操作时手尽量不要从敞开容器口的上方经过，移液管和枪头注意及时更换及用酒精棉球擦拭，实验完毕及时收拾操作台面，用酒精棉球擦拭台面。

2. 记录：提前做好实验记录，并记录好姓名、细胞名、日期等，冻存细胞应标注传代次数、冻存日期、复苏次数等。

其他问题以后会慢慢总结，此记录仅为了学习参考，如有不足之处还望大家提出，我们共同讨论学习，共同进步，等有时间详细记录一下细胞计数及铺板，今天到这里啦，以后会慢慢记录更多的实验记录。