关于兔脑微血管原代细胞培养的问题

实验方法：

1. 通过颈动脉放血将兔处死，去头皮。将头颅取出并浸入 75%的乙醇中，消毒约 1min。在

无菌状态下迅速取出兔大脑皮质。需小心剔除大血管和软脑膜；

2. 将脑皮质放入 D-Hanks 液中，漂洗数次后，将其剪碎。置于玻璃研磨器内研磨，制成粗

悬液；

3.经孔径为 110μm 尼龙筛网过滤，将滤液以 4000r/min 离心 10min；

4. 弃离心后的上清液。给沉淀加入 15%右旋糖苷溶液，重新悬浮沉淀。然后，再以 4000r/min

离心 20min。收集微血管片段；

5. 用 0.05%胶原酶溶液消化 1h。用 Hanks 液洗涤并离心，给微血管片段加入含双抗的完全

培养基；

6. 接种到培养瓶中，置 37℃、5%CO2 的培养箱中（湿度 100%）培养

7. 24h 后换液，并观察细胞状态。

疑惑：已经按照步骤做了两次，但结果都与所看的文章不太符合，在纯化后没有获得呈

长短不一的“短棍状”和“串珠样”血管段，都是一些类似于组织碎片状的不透光小团块。

我反思了一下，脑微血管内皮细胞培养本身存在一些难点：

1、BMEC 难以存活、髓鞘脂质较难去除，血管段易崩解，细胞易解离，以及操作易污染，

并且试验所用的是成年白兔，其大脑发育已成熟，BMEC 的体外培养增殖活力相对下降，

不易达到汇合状态；

3、在观看小鼠脑微血管内皮细胞提取的视频时，观察到在灭菌的滤纸上去除脑干、小脑及

皮质表面的软脑膜、大血管等，分离出大脑皮质。在对兔的大脑组织进行软脑膜、大血管的 分离时，发现在未配备体视镜的情况下仍较易剥离（在含有双抗 PBS 的培养皿中操作），但 髓质与皮质较为黏连，不宜分离，这里我选择用镊子挑取大脑皮质，这样就会导致取的都是 组织碎块，会让血管短断裂开，这里我也一时没想到其他的办法。并且，在去除间脑之后还 是会有髓质与皮质相连的部分（这里我在想是否不用把髓质去的太干净，在之后的密度梯度 离心会去除掉？）；

4、使用Ⅱ型胶原酶消化时，时间未确定好，这里选用的 0.2%Ⅱ型胶原酶（用基培进行溶解） 消化 1h，时间有待优化；

5、我是按照文献 24h 进行换液，换液之前液体明显有许多杂质及细胞碎片，在换液后镜下

观察发现液体内细胞类型物质特别少，是因为太早换液以至于细胞还未贴壁就被换掉了？ 

实验室未进行过脑微血管内皮细胞的培养，在此详述了实验步骤和思考的问题，希望与

大家交流解惑！

最后长出如下细胞：