Cell Reports ​( Q1, 9.423) |​肿瘤干细胞塑造肿瘤微环境的免疫抑制和促肿瘤小环境

文章题目：Tumor- initiating stem cell shapes its microenvironment into an immunosuppressive barrier and pro-tumorigenic niche

发表期刊：Cell Reports

影响因子：9.423

发表时间：2021年

合作单位：Stowers Institute for Medical Research

样品类型：APCMin/+ mice (both male and female)，Bmi1-CreER mice with R26-LSL-GFP and Apcmin/+ mouse lines (both male and female)，Adult human familial adenomatous polyposis (FAP) and colorectal cancer (CRC) paraffin-embedded tissue sections

运用技术：10x Chromium 单细胞，流式细胞术，巨噬细胞耗竭，WB，免疫组化，免疫荧光，投射电镜(TEM) ，扫描电镜(SEM)

研究背景

肿瘤微环境（tumor environment，TME）由肿瘤相关基质细胞、内皮细胞、组织驻留和募集的先天免疫细胞（即肿瘤相关单核细胞和巨噬细胞以及适应性免疫 T 细胞和 B 细胞组成，肿瘤与肿瘤微环境密切相关，肿瘤可以通过释放细胞信号分子影响其微环境环境，促进肿瘤的血管生成和诱导免疫耐受，而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞增长和发育。肿瘤干细胞（tumor stem cell，TSC）是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，对耐药性和免疫逃逸至关重要， 然而其与肿瘤微环境之间的直接相互作用在很大程度上仍不清。

重要结果

文章作者首先鉴定了TrTSC的存在和其性质，在用DNA标记保留区分活跃增殖肿瘤细胞和慢循环肿瘤细胞的基础上，应用单细胞RNA测序来全面解析TME中的细胞组成。而高质量的单细胞样品制备对后续测序建库至关重要，为此作者使用了高效温和、稳定可靠的gentleMACS全自动组织解离器，运行优化的预置程序，再用细胞滤器和死细胞去除试剂盒进一步纯化，去除细胞团块和死细胞，获得高得率、高活性的固有层间充质单细胞。其高质量的测序结果不仅揭示了TME中的不同细胞类型，还为进一步数据分析寻找TrTSC-TME互作信号通路提供了坚实的数据基础。

放化疗期间所有细胞单细胞RNA测序数据的UMAP分析

随后作者应用CellPhoneDB 配体-受体数据库对单细胞RNA测序数据的分析显示来自多种TME细胞类型的复杂信号通路，提示骨髓来源细胞（myeloid-derived cell, MDC）在放化疗急性响应期间具有抑制细胞毒性CD8+T细胞和促进TSC存活和增殖的双重作用。为了验证这一假说，作者使用磁性细胞分选技术从MDC中富集单核细胞组分（M-MDC），与腺瘤衍生类器官进行离体共培养，证实M-MDC能够促进腺瘤类器官生长。基于分选柱的MACS®技术，仅需最少量的纳米级磁珠标记即可实现高效分选，保留目的细胞原有特性，并提供从手动到自动化操作的多种方案。

离体共培养的腺瘤衍生类器官生长变化图像（A）及不同条件下类器官质量的量化（B）。Cele和EP4-I处理用于检测M-MDC对腺瘤衍生类器官的促生长作用是否通过Cox-2-PGE2-EP4信号途径。

为了进一步验证M-MDC在体内支持肿瘤发生的作用，文章用流式细胞分析检测了放化疗对MDC亚群的影响及巨噬细胞直接耗竭对肿瘤发生的效应，发现用Clodrosome耗竭肿瘤相关巨噬细胞后腺瘤显著缩小且数量减少，从而在离体和体内实验中都证实了以TAMM为代表的TME促肿瘤生长作用。MACSQuant流式细胞仪，可为各种应用提供自动化的流式细胞分析解决方案，实现要求严格且多样化的流式细胞术应用。

Clodrosome处理耗竭肿瘤相关巨噬细胞，减少肿瘤数量（H）。I-K，流式细胞分析结果。

原文总结

采用多种方法在肠腺瘤/癌小鼠模型中鉴定了耐受放化疗的治疗抗性肿瘤干细胞（therapy-resistant tumor stem cell，TrTSC），并发现TrTSC将TME，尤其是肿瘤相关单核细胞和巨噬细胞（tumor-associated monocyte and macrophage，TAMM）塑造成免疫抑制屏障和促肿瘤生长小生境。使用腺瘤-类器官共培养等发发，发现了 cyclooxygenase-2 (Cox-2) 依赖性信号传导的功能作用，主要发生在肿瘤相关单核细胞和巨噬细胞 (TAMM) 和 TrTSC 之间。最终确定了 TAMM 通过前列腺素 E2 (PGE2)-PTGER4(EP4) 信号传导促进 TrTSC 增殖，后者通过 AKT 磷酸化增强 β-catenin活性。