冰冻切片做免疫组化和尼氏染色

步骤如下，希望各位帮忙找找原因：大鼠麻醉后生理盐水灌注直到流出的水透明为止，然后冰盒上取出脑组织，放入多聚甲醛固定过夜，然后放入多聚甲醛配置的20%、30%蔗糖溶液中依次脱水（直到完全沉底才转入下一个），在-20˚c用OCT包埋，过夜后切成20µm厚的片子，在56˚c恒温箱中烤片两个小时，后面就按照免疫组化和尼氏染色的步骤做了，谢谢大家帮我找找原因

1.冰冻切片做的免疫组化都是有这种空洞，请问怎么解决

2.冰冻切片切好后需要烤片吗