体外酶实验的一些小总结

大家好，作为做科研的小白，有实验问题翻一翻论坛已经成为了习惯，在下做酶实验已经有一段时间了，根据自己的实验经验写一些关于构建酶实验的小总结，如有不对的地方请尽管指出，谢谢！

下面开始对酶实验进行简单介绍：

一、酶实验包括三个东西：酶、底物和产物。额外两个：缓冲液及终止液

酶：购买时酶单位一般是unit(简写U）或KU，实验中单位一般是U/ml，购买时有液体装和粉末装两种。具体单位需要看购买的酶官网上说明书,如sigma的酪氨酸酶T3824-25KU来源于蘑菇中说明中为1000unit/mg,瓶内有少量粉末不能用来称量，所以只能用缓冲液如PBS加入一定体积（如1ml）之后混匀，此时酶的浓度为25KU/ml.另外，还需要关注说明书中酶适用的PH、温度等条件。一般需要计算购买的酶的实际单位的是液体装酶，如sigma的黄嘌呤氧化酶X1875-5UN，为瓶装液体，瓶身写有16mg protein/ml,0.7unit/mg protein,0.5ml，这样算下来酶的浓度为11.2U/ml,瓶内酶的总量为5.6U，就不能按照5U来计算了。

底物：具体物质可以参考购买酶说明书中的底物，单位有mol/ml、mg/ml 两种。粉末溶解时使用的溶剂与溶解酶的溶剂相同。

产物：一般做酶实验时，检测酶活性指标一般有两种：检测产物OD值或检测产物OD值，一般检测产物OD值比较多。用酶标仪检测的波长设置是按照检测指标中的物质的波长设置的。

缓冲液：有PBS、RO水两种，看酶适用的缓冲液条件。

终止液：一般是盐酸溶液或氢氧化钠溶液，但是假如终止液后可能会使产物OD值增加。终止液不是一定要加的，主要看酶反应在相应规定时间后是否继续反应。

二、酶实验设计

分组设计：

正常酶组、正常对照组、阳性药组、阳性药对照组、样品酶组、样品对照组

为两大组：一组为酶组；另一组为对照组。样品及阳性药组设置6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。

酶组内需要加酶；

对照组为除不加酶外，其他试剂与酶组相同，体积相同，用缓冲液补足。对照组的作用是后续计算时扣除背景值的影响，另一个作用是观察样品与底物是否反应。

体积设计：

为实验便捷，我一般用96孔板实验，所以总体积需要控制在250ul以下，一般是200ul或150ul体积，酶体积50ul、底物体积50ul，加样体积50ul，缓冲液50ul。

酶标仪OD值设计：

我一般选正常组扣除背景值即调零OD值（=正常酶组OD值-正常对照组OD值）为1.2左右为宜。

正常组凋零OD值-时间曲线分析：

一般OD值-时间曲线形状如下：

但是第一次设计剂量并不一定就这么完美，需要根据酶标仪检测的OD值对时间变化曲线进行分析，从而进行剂量调整。

两种情况：

在加入酶和底物后，设置检测时间点为1min、5min、10min、15min

• 如果检测出调零OD值变化不大，那么也有两种情况分析：

第一种：酶在较短时间内（1min）内反应完毕，出现的原因：酶的量过多，下一步注意设置酶的浓度梯度，底物的量先不变。

第二种：调零值为零，即没有产生底物，此时需要分析是否是酶的问题，是否忘记加酶活忘记加底物了。

• 如果检测出OD值有变化，两种情况：

第一种：变化缓慢，如果曲线在上图曲线的右边即上升完毕趋于平缓，则说明反应过慢，需增加酶的量。

第二种：变化较快，如果曲线在上图曲线的左边即上升完毕趋于平缓，则说明反应过块，需降低酶的量。

调整酶与底物体积后反应曲线与上图类似后可按比例调整酶与底物的剂量或浓度，使得调零OD值达到1.2左右。

另外，酶实验与细胞实验不同的是，酶、底物一般说明总量而不是浓度，如在200ul体系中2U单位的酶在15min内能与10mmol的底物反应完毕。

怎么样，听起来酶实验是不是比细胞实验简单多了？