海马呼吸（seahorse）实验经验总结

最初决定做这个实验也是因为自己送RNA-seq的结果有富集糖酵解通路。近些年，肿瘤的代谢也是肿瘤学研究的热点与难点。说实话，我和师兄讨论了这个实验后他是劝我不要深入地做下去的，毕竟我在做肿瘤代谢这一块没有太多的经验，也没有人脉能够找到兄弟实验室的老师去学习。在查阅了相关文献后我开始对这个实验感兴趣，甚至边做实验边听陈晓菲教授的讲座，收获很大，也有了信心。于是很想尝试一下。

那么问题来了，实验费用昂贵，一块安捷伦96孔cell plate就要近千元，如果加上试剂以及其它的耗材，做一次实验大约就要两千多元。而且，实验不可能做一次就成功，前期还有很多条件要摸索。公司给你的是六次实验耗材，大约需要两万元，妥妥的一个小型奢侈包包。老板会批准吗？不过顺利的是组会汇报后得到了老板的支持。我为有一个敢于与我们不断尝试新事物的老板而感到高兴。在实验的最初也希望可以从丁香园获得一些讯息，怕走弯路，毕竟实验耗材相当昂贵。发现并没有任何帖子，所以我想写下我的经验，一来为自己的实验整理下思路，二来也可以和其它科研人员一同学习进步。

在这里，我首先提出大家熟知的一个概念“Warburg”效应，是由德国生理学家瓦博格发现的，就是说肿瘤在氧富余的情况下依旧具备活跃的糖酵解能力，呈现一种“有氧糖酵解”的状态从而为肿瘤细胞生长供应能量，实现其无限增殖。因此，研究肿瘤的糖酵解的确是具备其潜在的价值的。那么在我的研究中也发现了糖酵解对肿瘤的生物学行为能够产生影响。这为我的实验增添了信心。

那么，这里我主要想讨论的是ECAR（extracellular acidification rate）和 OCR（oxygen consumption）这两个实验。简要地说ECAR主要用来测细胞糖酵解能力，而OCR主要是看细胞的有氧呼吸能力。我们知道糖酵解和有氧磷酸化是细胞内主要的能量生产途径，细胞具备两条途径的转换能力从而适应外部环境的变化。细胞中的葡萄糖（Glucose）转化为丙酮酸（Pyruvate），进而在胞质中转化为乳酸（Lactate）或进入线粒体生成CO2和水。

葡萄糖转变为丙酮酸（糖酵解）和后来的乳酸，使质子排到细胞外的培养基中。因此，ECAR实验检测的就是培养基中的PH值。那么ECAR实验中分别注射的药物葡萄糖、寡霉素（oligomycin）以及2-DG分别又起到什么作用以及相对应检测的指标是什么呢？葡萄糖检测的是基础糖酵解的能力也称为糖酵解速率，注射后曲线上升；寡霉素抑制有氧呼吸让细胞转变为糖酵解检测的是细胞糖酵解的储备能力，曲线上升；2-DG是一种葡萄糖类似物通过竞争性结合糖酵解关键酶己糖激酶抑制糖酵解，证实ECAR的上升来源于糖酵解，称为非糖酵解的酸化。

那么，OCR我们又称之为线粒体压力实验，用细胞的氧耗速率（OCR）来代表线粒体功能。那么同样试剂盒会提供三种药物：寡霉素、FCCP、鱼藤酮（Rotenone）和抗霉素A（Antimycin A），每种药物都起到不同的作用。寡霉素抑制ATP合酶，导致线粒体呼吸减少，注射后曲线OCR下降。FCCP是一种解偶联剂，破坏质子梯度和线粒体膜电位，线粒体复合物IV耗氧达到最大，因此FCCP激发出来的是细胞最大的呼吸能力，曲线上升。最后的鱼/A，是线粒体呼吸链复合物I和III的抑制剂，联合关闭线粒体呼吸，曲线下降。

接下来我们重点讨论下实验的流程以及一些小tips。实验的前一天我们需要做的准备工作有三件：水化探针板、开机开wave软件以及铺细胞。探针板的上方有一块加药辅助板，可抛弃。细胞的密度可以从安捷伦公司的学习网站上下载与你研究方向相关的文献作为参考，也可以用一块cell plate铺一个titration进行摸索，保证12小时细胞融合度80-90%。铺板的培养基使用普通培养基。水化使用高压过的dd水，水化的探针板必须放置在无CO2的培养箱中过夜，次日晨换成calibration water（37度预温）。注意不要触碰探针板的表面。

实验的第二天，首先，根据你的实验要求配置你所需要的培养基（检测液），比如公司购买的特殊DMEM，ECAR只需要加入谷氨酰胺，OCR则需要加入谷氨酰胺、葡萄糖以及丙酮酸。要保证培养基多配约10ml，因为后面的药物均需要这个作为基液。细胞换液的过程倘若根据公司提供的protocol的确有些搞脑子，根据你细胞的情况决定使不使用公司的方案。我在做的过程中因为了解自己细胞的习性所以没有按照protocol来，我将原有培养基吸掉，加入检测液，再用检测液清洗一遍即可，96孔最后终液体为180微。可以再次观察下细胞状态。换好的细胞放置于无CO2的培养箱中。然后，将水化板的探针板换成校准液。最后按照说明书的要求配制药物，进行加药。加药孔分成四个孔，ABCD，这两个实验只需要用到前三个孔。加药孔的底部有一个很小的孔，药物通过液体的表面张力而不漏出。因此加药的过程中需要注意倾斜45度，在孔柱的中上三分之一加药，如果过于垂直或往下可能导致药物直觉漏掉，过于往上可能导致药物挂壁而加药失败。不过，这真的是件很艰巨的活儿，又必须很专注，通常一块板子加药需要一小时左右。如果你的孔加错了比如B孔加到了C孔，那么可以在软件里设置你的加药孔的药物，只要最后机器可以识别正确的加药顺序即可。

下面是两种实验的简要流程：

此外，FCCP的浓度需要摸索。因此在实验的过程中我先做了ECAR确定了最佳细胞密度之后再进行FCCP浓度的摸索，因为你不可能每一个细胞密度再进行四个浓度的摸索，排列组合你的板子肯定不够用。如果你的实验室有其它同学需要做也可以合并一个板子做，可以省一些经费。

最后，为了实验的准确性，最好再对细胞进行计数。数据的分析使用wave2.6，你可以把原始数据拷贝下来后在电脑上进行modify，并不一定要在上机的时候做这个工作。

我们最终实验比较成功，要感谢技术指导在实验室陪同的一天，也感谢辉辉师妹的指导和帮助。希望我的帖子可以帮助到准备做seahorse的科研小伙伴，让我们做一个勇于挑战的人～～加油