血管形成/生成/成管实验,肿瘤研究之体外血管生成相关基因/通路研究
血管生成(Angiogenesis) 是正常组织生长及损伤修复的必要过程,是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管,其对于器官生长、胚胎发育和伤口愈合在内的多种过程十分重要。
肿瘤组织具有高度血管化的特征,肿瘤的生长依赖于新生血管,新生血管也可能是肿瘤治疗的靶标,由于发现了血管生成因子对血管生成的作用,以及血管生成对肿瘤生长和侵入转移、特别对肿瘤早期发生的重要影响,肿管生成成为近年来肿瘤研究的热点之一,为肿瘤治疗开辟了一个新的思路。

血管生成:生理或者病理
在生理条件下,血管生成分为两种过程:一种是利用内皮组细胞,其来源于骨髓,并启动内皮生长和血管生成;另一种是根据现有的脉管系统生成新的血管,高度依赖于内皮细胞的活化和蛋白酶的分泌。生理条件下的血管生成包括胚胎发育、损伤修复等。
在病理条件下,血管生成的步骤基本与正常生理条件下的一致,然而,形成的结构通常在功能上是异常的。病理状态下的血管生成包括如下情况:
1. 过量血管生成:如肿瘤生长与转移、类风湿关节炎、糖尿病性视网膜病变、炎症性疾病、动脉粥样硬化。
2. 血管生成不足:如慢性损伤、冠状动脉疾病、中风、不愈合骨折。
血管生成实验(Angiogenesis Tube Formation)
1. 概念
是体外研究血管生成的经典方法,该方法可快速确定参与血管生成的基因或通路,体外的血管生成实验能很好的模拟肿瘤的血管发生过程,并且适合研究药物对这一过程的影响实验。
2. 原理
内皮细胞保留了分裂和快速迁移的能力,可响应血管生成信号。基于内皮细胞在基底膜提取物(BME)上培养时形成三维毛细血管样管状结构的能力,是一种简单、定量、可靠且功能强大的模型,常用于研究血管生成的抑制剂和激活剂。
哪些细胞可以进行血管形成实验?
多种类型的内皮细胞均可用于本实验,包括原代细胞和永生化细胞系。常用的有人脐静脉内皮细胞(HUVEC),之所以不采用静脉血管内皮细胞与动脉血管内皮细胞是因为HUVEC具有干细胞的潜能,理论上可以传代50-60次。
实验材料

实验步骤
1. 准备内皮细胞
(1)以3B-11细胞为例,检测前两天将3B-11细胞传代。细胞传代次数很重要,当细胞在第2代和第6代之间时,血管形成效果最好:
(2)细胞在含10% FBS,2mM L-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中培养24小时。
(3)实验前一天,血清饥饿3B-11细胞:
先从3B-11细胞中弃去培养基,加入含0.2% FBS,2mM L-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养24小时。
2. 实验试剂准备
(1)基底膜提取物(basement membrane extract, BME)购自BD Biosciences公司,Cat Number为354230:
值得注意的是BME浓度因批次而变化很大。如果浓度低于10mg/ml,BME就不能很好工作,因此应该在购买之前联系代理商,以确保获得足够集中批次的试剂。
(2)BME小瓶使用前一天浸入置于4度冰箱的冰中过夜解冻,解冻后,旋转小瓶以确保混匀。融化后的基质胶在15℃以上,会迅速凝固,操作的时候放置在冰上,防止过早凝固。
此外,与基质胶接触的所有培养器皿、耗材和培养液均应预冷,整个实验过程需始终保持基质胶置于冰上。对融化后的基质胶进行分装,需用预冷的冻存管,迅速冷冻并保存,避免多次冻融。
(3)用于信号通路研究时,低生长因子的BME(Reduced growth factor BME)比起传统的BME更可取,因为排除了生长因子的干扰。
3. 实验前内皮细胞的准备
(1)使用杜氏磷酸缓冲液(DPBS,和常用标准PBS区别是不含钙、镁离子)清洗3B-11细胞,加入适量含EDTA胰蛋白酶消化细胞。
(2)培养基终止消化后使用100μm细胞滤网过滤细胞,去除结块。
(3)在含10% FBS,2mM L-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中计数细胞至最终浓度7.5x106个细胞/ml。所种细胞数也会影响血管形成效果,不同细胞类型密度需摸索:
4. 血管形成实验
(1)将24孔板和1ml枪头放在冰箱或冰上20-30分钟后再使用,这样BME就不会过早固化。
(2)将250µl低生长因子的BME加入24孔板中,移液过程中避免产生气泡,确保胶完全覆盖孔底。
(3)将24孔板在37°C和5% CO2中孵育30分钟以固化BME。
(4)将大约300µl的培养基与10µl重悬的3B-11细胞(约75,000细胞)混合。根据使用的内皮细胞类型调整培养基的体积和细胞数,例如HUVEC 96孔板每孔细胞数约2-3x104个。
(5)Tubes将在2-4小时内开始形成,这取决于培养基中血管生成因子的浓度,小管形成的峰值可能发生在3到12小时之间,并且需要优化检测的时间。如果使用原代内皮细胞而非永生化细胞,开始成管的时间会延迟几个小时。一般而言成管会在18小时内开始恶化,内皮细胞将发生凋亡:
(6)在血管形成的最佳时间小心去除培养基,避免破坏BME上的血管网络。使用1ml DPBS洗涤后加入1ml新鲜DPBS,使用倒置显微镜或荧光/共聚焦显微镜(如果细胞被Calcein AM染色)对管状网络进行成像。当然也可使用4%的多聚甲醛室温固定15min后进行成像。
定量分析血管形成网络
按照细胞的生长速度定时采集图像,并且对其成管长度、覆盖面积、成环数、结点数等进行测量和记录,并且使用 ImageJ插件Angiogenesis Analyzer对血管网络进行统计分析,之后在对测量结果进行统计分析以说明实验结果。

ImageJ插件Angiogenesis Analyzer生成原始数据

注意事项
(1)细胞传代次数很重要,当细胞在第2代和第6代之间时,血管形成效果最好。使用第2代之前或第10代之后内皮细胞会影响。
(2)基底膜提取物(basement membrane extract, BME)浓度因批次而变化很大。如果浓度低于10mg/ml,BME就不能很好工作,因此应该在购买之前联系代理商。
(3)用于信号通路研究时,低生长因子的BME(Reduced growth factor BME)比起传统的BME更可取,因为排除了生长因子的干扰。
(4)过薄的 BME 胶不能够支持内皮细胞形成血管,一般来说,96 孔板中使用 50-80 μL/孔的 BME 较为合适。
(5)以 HUVECs 为例,比较孵育 16 小时后的状态:HUVECs 的细胞接种密度影响血管样网络的形成,细胞接种密度在 4,800-6,400 细胞/cm² 为最优。
(6)根据分析的细胞类型而定,原代内皮细胞在 6-20 小时内形成血管样网络,小管形成的峰值可能发生在3到12小时之间,并且需要优化检测的时间,永生化细胞在 2-3 小时内形成血管。一般而言成管会在18小时内开始恶化,内皮细胞将发生凋亡。