血管形成/生成/成管实验，肿瘤研究之体外血管生成相关基因/通路研究

  血管生成（Angiogenesis） 是正常组织生长及损伤修复的必要过程，是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，其对于器官生长、胚胎发育和伤口愈合在内的多种过程十分重要。

      肿瘤组织具有高度血管化的特征，肿瘤的生长依赖于新生血管，新生血管也可能是肿瘤治疗的靶标，由于发现了血管生成因子对血管生成的作用，以及血管生成对肿瘤生长和侵入转移、特别对肿瘤早期发生的重要影响，肿管生成成为近年来肿瘤研究的热点之一，为肿瘤治疗开辟了一个新的思路。

血管生成：生理或者病理

在生理条件下，血管生成分为两种过程：一种是利用内皮组细胞，其来源于骨髓，并启动内皮生长和血管生成；另一种是根据现有的脉管系统生成新的血管，高度依赖于内皮细胞的活化和蛋白酶的分泌。生理条件下的血管生成包括胚胎发育、损伤修复等。

在病理条件下，血管生成的步骤基本与正常生理条件下的一致，然而，形成的结构通常在功能上是异常的。病理状态下的血管生成包括如下情况：

   1. 过量血管生成：如肿瘤生长与转移、类风湿关节炎、糖尿病性视网膜病变、炎症性疾病、动脉粥样硬化。

   2. 血管生成不足：如慢性损伤、冠状动脉疾病、中风、不愈合骨折。

血管生成实验（Angiogenesis Tube Formation）

   1. 概念

是体外研究血管生成的经典方法，该方法可快速确定参与血管生成的基因或通路，体外的血管生成实验能很好的模拟肿瘤的血管发生过程，并且适合研究药物对这一过程的影响实验。

   2. 原理

内皮细胞保留了分裂和快速迁移的能力，可响应血管生成信号。基于内皮细胞在基底膜提取物（BME）上培养时形成三维毛细血管样管状结构的能力，是一种简单、定量、可靠且功能强大的模型，常用于研究血管生成的抑制剂和激活剂。

哪些细胞可以进行血管形成实验？

多种类型的内皮细胞均可用于本实验，包括原代细胞和永生化细胞系。常用的有人脐静脉内皮细胞（HUVEC），之所以不采用静脉血管内皮细胞与动脉血管内皮细胞是因为HUVEC具有干细胞的潜能，理论上可以传代50-60次。

实验材料

实验步骤

    1. 准备内皮细胞

（1）以3B-11细胞为例，检测前两天将3B-11细胞传代。细胞传代次数很重要，当细胞在第2代和第6代之间时，血管形成效果最好：

（2）细胞在含10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中培养24小时。

（3）实验前一天，血清饥饿3B-11细胞：

先从3B-11细胞中弃去培养基，加入含0.2% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养24小时。

    2. 实验试剂准备

（1）基底膜提取物（basement membrane extract, BME）购自BD Biosciences公司，Cat Number为354230：

值得注意的是BME浓度因批次而变化很大。如果浓度低于10mg/ml，BME就不能很好工作，因此应该在购买之前联系代理商，以确保获得足够集中批次的试剂。

（2）BME小瓶使用前一天浸入置于4度冰箱的冰中过夜解冻，解冻后，旋转小瓶以确保混匀。融化后的基质胶在15℃以上，会迅速凝固，操作的时候放置在冰上，防止过早凝固。

此外，与基质胶接触的所有培养器皿、耗材和培养液均应预冷，整个实验过程需始终保持基质胶置于冰上。对融化后的基质胶进行分装，需用预冷的冻存管，迅速冷冻并保存，避免多次冻融。

（3）用于信号通路研究时，低生长因子的BME（Reduced growth factor BME）比起传统的BME更可取，因为排除了生长因子的干扰。

     3. 实验前内皮细胞的准备

（1）使用杜氏磷酸缓冲液（DPBS，和常用标准PBS区别是不含钙、镁离子）清洗3B-11细胞，加入适量含EDTA胰蛋白酶消化细胞。

（2）培养基终止消化后使用100μm细胞滤网过滤细胞，去除结块。

（3）在含10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中计数细胞至最终浓度7.5x106个细胞/ml。所种细胞数也会影响血管形成效果，不同细胞类型密度需摸索：

     4. 血管形成实验

（1）将24孔板和1ml枪头放在冰箱或冰上20-30分钟后再使用，这样BME就不会过早固化。

（2）将250µl低生长因子的BME加入24孔板中，移液过程中避免产生气泡，确保胶完全覆盖孔底。

（3）将24孔板在37°C和5% CO2中孵育30分钟以固化BME。

（4）将大约300µl的培养基与10µl重悬的3B-11细胞(约75,000细胞)混合。根据使用的内皮细胞类型调整培养基的体积和细胞数，例如HUVEC 96孔板每孔细胞数约2-3x104个。

（5）Tubes将在2-4小时内开始形成，这取决于培养基中血管生成因子的浓度，小管形成的峰值可能发生在3到12小时之间，并且需要优化检测的时间。如果使用原代内皮细胞而非永生化细胞，开始成管的时间会延迟几个小时。一般而言成管会在18小时内开始恶化，内皮细胞将发生凋亡：

（6）在血管形成的最佳时间小心去除培养基，避免破坏BME上的血管网络。使用1ml DPBS洗涤后加入1ml新鲜DPBS，使用倒置显微镜或荧光/共聚焦显微镜(如果细胞被Calcein AM染色)对管状网络进行成像。当然也可使用4%的多聚甲醛室温固定15min后进行成像。

定量分析血管形成网络

按照细胞的生长速度定时采集图像，并且对其成管长度、覆盖面积、成环数、结点数等进行测量和记录，并且使用 ImageJ插件Angiogenesis Analyzer对血管网络进行统计分析，之后在对测量结果进行统计分析以说明实验结果。

ImageJ插件Angiogenesis Analyzer生成原始数据

注意事项

（1）细胞传代次数很重要，当细胞在第2代和第6代之间时，血管形成效果最好。使用第2代之前或第10代之后内皮细胞会影响。

（2）基底膜提取物（basement membrane extract, BME）浓度因批次而变化很大。如果浓度低于10mg/ml，BME就不能很好工作，因此应该在购买之前联系代理商。

（3）用于信号通路研究时，低生长因子的BME（Reduced growth factor BME）比起传统的BME更可取，因为排除了生长因子的干扰。

（4）过薄的 BME 胶不能够支持内皮细胞形成血管，一般来说，96 孔板中使用 50-80 μL/孔的 BME 较为合适。

（5）以 HUVECs 为例，比较孵育 16 小时后的状态：HUVECs 的细胞接种密度影响血管样网络的形成，细胞接种密度在 4,800-6,400 细胞/cm² 为最优。

（6）根据分析的细胞类型而定，原代内皮细胞在 6-20 小时内形成血管样网络，小管形成的峰值可能发生在3到12小时之间，并且需要优化检测的时间，永生化细胞在 2-3 小时内形成血管。一般而言成管会在18小时内开始恶化，内皮细胞将发生凋亡。