【打基础】助你独立操作细胞实验方法及细节讲解

本贴为各位带来细胞实验步骤和细节讲解，希望你看过之后能对细胞实验有个清晰的了解，只要你足够的细心，看完之后完全有能力自己独立操作哦……

基本准备工作

灭菌、消毒

1. 无菌室和操作区消毒

实验前用 70% 乙醇擦净洁净台，再将实验器材放入超净工作台，打开紫外线灭菌灯，40 分钟后消毒完毕，关闭紫外线灯，打开吹风，注意两扇门不要同时打开。细胞房每周都要打开房间的紫外线灭菌灯进行整体消毒。长期未使用的细胞房在实验前需要用 20% 乙酸蒸 24 h。

2. 二氧化碳培养箱消毒

二氧化碳培养箱定期需要用 70% 乙醇擦拭托盘和内壁，同时使用手提紫外灯进行消毒。培养箱低端托盘的水也要为无菌水，并两周更换一次。

3. 器皿灭菌、消毒

玻璃器皿和螺口盖采用高压灭菌（121 ℃，100 kPa，20 min），玻璃器皿包括移液管、冻存瓶、盖玻片、载玻片、玻璃注射器、玻璃试管、吸管等。 螺口盖的盖子分为有内垫的金属或酚醛树脂盖、聚丙烯盖子、硅树脂盖子、白橡胶盖子。塑料器皿的消毒通常采用紫外照射 4～6 h 的方法。PBS、hanks 等平衡盐溶液中的葡萄糖、高压灭菌时会融化变焦，所以要等高压灭菌之后再加。

4. 试剂和培养基

这类物质一般采用 0.22 μm 滤膜除菌。

基本手法

1. 用微量移液器在吸取和加入液体时，枪头须伸入瓶口以降低在空气中污染的几率；2. 像试剂瓶、培养瓶中加入试剂时，一般为右手持微量移液器，左手食指和拇指握住瓶身，食指和中指夹住瓶盖，并使瓶身适当的倾斜，尽量不要让瓶身竖直，更不能用手触摸瓶口。手小者可以将瓶盖扣在超净工作台的台面上。

3. 试剂瓶、培养瓶等盖上盖子前需要将盖子在酒精灯上晃一秒钟。

超净工作台物品摆放

复苏

1. 准备工作：提前开启恒温水浴锅，将温度调节在 37℃～41℃ 之间；取一细胞培养瓶，加入预热的完全培养基。提前加入培养基有助于接种时细胞能够均匀分散。

2. 取细胞：从液氮罐中取出细胞。从液氮罐中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

3. 融化：从液氮中取出冷冻管，立即放入水浴锅中快速解冻，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段 （-5～0 ℃），并在 1 分钟内完成融化，以 70% 酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

4. 接种：打开冻存管，室温下 5 min 内将冻存液小心转移到预先加入有培养基的培养瓶中，混合均匀，放入 CO2 培养箱培养。

5. 换液：十二小时内进行换液，除去上清液中的冻存液。或者在融化之后将细胞加入到含有培养基的离心管中，800 rpm 离心 5 分钟，去上清，加入新鲜培养基，混合均匀，放入 CO2 培养箱培养。

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明天继续更传代和冻存步骤（如果实在太基础没人看我就不更了）

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