【经验分享】蛋白表达载体构建

本人个人经历，做了了许多原核蛋白表达载体构建、蛋白表达纯化及结晶的工作，也涉及到慢病毒稳转细胞系构建，还有流式相关试剂的研发。蛋白的表达量在毫克级别。在整个实验过程也遇到了许多问题，同时也解决了一些问题，在这拿出来分享讨论，人多力量大，尽量少走弯路。我会挑选一些我个人觉得比较重要或者遇到过难题的实验步骤进行分享。如果有不详尽的地方，欢迎留言讨论，知无不言言无不尽。

表达载体构建我会放在这个板块分享。蛋白表达纯化放在【蛋白质和糖学-蛋白表达纯化】板块。链接：https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/45647906?fpap=1

关键词：原核细胞 可溶性蛋白 载体构建

一、引物设计

由于模板的不同，在引物的设计上也会不同。我所用的引物都是手工进行设计的，仅借助软件大致查看一下GC含量而已。以带有目的基因的质粒或目的基因为模板进行克隆的话，是比较简单的，直接设计带有酶切位点的引物即可。如果说模板为基因组DNA（原核）或者cDNA（真核）的话，我个人的策略是在基因组DNA中目的基因的上下游150bp左右的位置分别设计一条正向和反向引物做为粗扩引物，粗扩引物不带酶切位点，目的是为了增加引物的特异性，与模板的匹配长度保持在20个碱基左右，3’端碱基最好是GC，相邻碱基尽量避免重复，GC含量在50%左右。然后再根据所需扩增片段的基因序列，设计带有酶切位点和保护碱基的精扩引物，与模板匹配长度保持在30个碱基。以基因组DNA做为模板，用粗扩引物进行扩增，胶回收大小正确的片段，再以该片段为模板，用精扩引物扩增出所需的目的片段。

二、PCR产物及质粒酶切

我用的是双酶切的方法，内切酶用的最多的是NEB的，Takara也用过，都没什么问题。双酶切体系是50 μL，DNA片段或者质粒的量是1.5 μg（根据浓度换算出体积），两种限制性内切酶分别加1.5 μL（其实只要对应多少μg的DNA就加多少μL的内切酶就好了）。酶切时间我用最多的就是4小时或8小时，感觉酶切的效果比较好。

三、目的片段与载体连接

10 μL的体系，1 μL的T4 DNA连接酶，1 μL 10×缓冲液，剩下的8 μL加目的片段和载体即可。在8 μL的总体积范围内，我会使目的片段与载体的摩尔比保持在4:1~9:1之间，我的个人感觉是在这个比例之间连接效率挺高的。连接的条件是16 ℃，过夜即可。我也尝试过在16 ℃放置一周之后的连接产物做转化，也是没有任何问题。

四、重组质粒鉴定

重组质粒鉴定为什么要在这里写呢。主要是因为之前我们实验室只用双酶切的方法进行鉴定，用快切酶进行双酶切鉴定，跑胶看是否有双条带，并且条带位置和目的片段及载体大小差不多，就会拿这个质粒去做测序。但是有一段时间，无论转化之后菌落长得多或者长得少，在平板上挑取一些单菌落（因为平板上单菌落很多很多，如果都挑取出来进行培养不现实）培养之后提取质粒进行的双酶切鉴定跑胶结果显示没有任何阳性的克隆，于是就是重复酶切、连接、转化、提质粒、酶切鉴定的工作，依然没什么进展。后来我就决定同时使用菌落PCR和双酶切进行重组质粒的鉴定。结果……结果发现效果真不错，阳性克隆就这么被找到了，原来才发现并不是酶切或者连接的问题。