实验方法：荧光原位杂交

原 理:

原位杂交技术（in situ hybridization）是 以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互 补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

实验流程：

一．            细胞爬片或者冰冻切片

1.      冰冻切片厚度5-8um，用防脱片载玻片；细胞爬片的盖玻片要用多聚赖氨酸处理。防止脱片。

2.      细胞爬片或冰冻切片均可用下述方法固定：用RNA Free4%多聚甲醛室温固定20-30min，用DEPC水充分水洗，自然干燥后-20℃冷冻可保存2周以上。

3.      制作湿盒：用5×SSC（PH:7.5）（35ml）+甲酰胺（35ml）置于湿盒内。

4.      30%H₂O₂1份+9份纯甲醇混合液室温处理10min。DEPC水洗3次，每次1min;

5.      切片置于湿盒内，用0.25%盐酸滴于组织上，常温15min，用DEPC水洗2次，每次1min（盐酸可中和带电荷的碱性蛋白，降低背景）

6.      蛋白酶K覆盖组织，分子杂交仪中37℃20min。蛋白酶K可以消化和暴露被遮蔽的靶核酸，增加探针的结合效率。

7.      用0.2%或0.1mol/L甘氨酸洗液洗1min（现用现配），终止蛋白酶K。

8.      PBS洗两次，每次一分钟。

9.      用4%PFA多聚甲醛固定组织10min。

10.  PBS洗三次，每次1min。

11.  用acetic anhydride乙酸酐ph=8.0（乙酰化作用，降低背景）室温洗5min，2次.(乙酸酐溶液配制：每50ml三乙醇胺水溶液中加126ul乙酸酐，现用现配，按比例配制，用多少配多少)。用PBS洗5次，每次1min。

12.  用5×SSCph7.5洗两次，每次1min。

13.  切片放置湿盒内，用预杂交液 覆盖组织，65℃预杂交 1h。

14.  100u M 的探针母液可以1:500—1000稀释，FITC -labeled pube 探针覆盖切片，在杂交仪内62-70℃黑暗反应24~72h，反应温度与反应时间视不同的组织与探针而定，建议一般65℃48h。

15.  用2×SSC ph=7.5，室温洗1次，1min。

16.  用甲酰胺 加4×SSC ph=4.5 1:1混合液在60℃或65℃洗三次，每次20min。

17.  用PBS洗5次，每次1min，室温。

18.  用DEPC处理水1000倍稀释DAPI，染核5min。

19.  用PBS洗３遍，每遍5min.

20.  滴加防淬灭剂，盖盖玻片。指甲油封片，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。

二．石蜡切片

如果有条件的话，尽可能采用新鲜标本，及时固定。固定液一定要用RNA Free PFA固定液固定，固定时间为1小时，较大标本不超过2小时。标本较大时用锋利刀片切成厚度不超过4mm的小块。动物大脑固定时间30-40min，一般不超过1小时。

1.      常规脱蜡至水洗。

2.      按照细胞爬片和冰冻切片实验流程3步开始操作。