简单的说下透射电镜样本准备的方法及要求

透射电镜样本准备方法及要求

首先需要做电镜的样本必须尽量新鲜，固定液或悬浮液都不得冷冻结冰（这个需要注意）

1、 动物组织样本

（1） 大的组织块取样，1-3min内立即置于4℃固定液中，然后马上在冰盒内将样品分割为横截面1mm2，长度不超过3mm的长条状。迅速投入4℃固定液中固定15分钟之后，再将组织切成1mm3小块，放入4℃固定液中固定（要请注意样品方向和定位，将需要切割的面定位成横截面1mm2或1mm3。）

（电镜所用固定剂穿透力较弱，为了与固定液的穿透速率相适应，样品块的大小不得超过0.5～1mm³以确保固定效果。）

 （2）特殊样品，如需要观察微丝微管结构的组织，取下应立即投入电镜固定液内室温固定1h，再转移至4℃保存；肝脏等含消化酶丰富的组织容易自溶，取样后应立即4℃低温固定和分割。

（3）快速：由于组织离体后，细胞缺氧导致溶酶体破裂而释放大量水解酶，造成组织结构的迅速降解，产生自溶现象。为了尽量保持样品的生活状态，将自溶的程度降到最低，从还有心跳与呼吸的动物体上取下样品后，组织块要争取在30秒内浸入固定液。

（4）准确：由于电镜观察范围有限，要求取材时尽量精确到需要观察的目的部位，然后在同一个部位取3～5块样品。（如观察肾小球取肾皮质；观察胰岛取胰岛丰富的胰尾；皮肤，肠胃等在固定液中易打卷的组织可将组织粘在滤纸上进行固定）。

（5）轻巧：取材时一定注意避免镊子挤压等机械损伤，刀片要锋利避免挫伤组织。在取材过程中，由于刀片不锋利或者操作不仔细，对样品产生牵拉、挤压等现象所造成的人工损伤都将导致其细胞结构的严重变化，因此在整个取材过程中自始至终动作要小心，器械要锋利

 （6）低温：为了降低组织和细胞内各种酶的活性，减缓细胞自溶的过程，要求在低温（0～4℃）下操作，所用固定液和器械应预冷，所有样品送样前，在固定液中浸泡不超过一周。4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

2、 植物组织样本

① 取材要求同动物组织样本。

② 组织投入固定液后需要进行真空抽气让组织沉底，如无条件抽气可用滤纸将组织塞进固定液内，组织不能漂浮在固定液表面。

3、 细胞样本

贴壁细胞：

（1）针对不易胰酶消化的细胞：培养好的细胞（细胞量5*10⁶，25cm瓶或10cm皿养满）弃培养基加入PBS用细胞刮轻轻刮下细胞收集到1.5mlEP内，离心收集（9000g 5min)细胞要肉眼可见细胞沉淀芝麻大小，弃上清后轻轻加入戊二醛室温固定1h，再转移至4℃保存，保存过程中固定液切勿冷冻结冰。

（2）针对大部分普通细胞样品：培养好的细胞（细胞量10⁶）用胰酶消化下来（时间越短越好），离心收集（3000rpm 5min)到1.5mlEP内，细胞要肉眼可见细胞沉淀芝麻大小，弃上清后轻轻加入戊二醛室温固定1h，再转移至4℃保存，保存过程中固定液切勿冷冻结冰。

（3）针对易变形结构，需原位观察的细胞：用24孔板（用其他的培养皿也可以，但用24孔板可以节省试剂。。。。），置入圆玻片(8x8或10x10)，爬满细胞后，将培养好的细胞（细胞量106）弃培养基加入PBS清洗后，轻轻加入戊二醛（进口）室温固定15min，再转移至4℃保存，保存过程中固定液切勿冷冻结冰。

悬浮细胞：离心收集细胞（9000g 5min)要肉眼可见细胞沉淀芝麻至绿豆大小，弃培养基后加电镜固定液室温固定2h，再转移至4℃保存，保存过程中固定液切勿冷冻结冰。

注意：需要外出运输要注意，需要用4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰，也不要剧烈震动，以免细胞散掉。