色谱柱的筛选

分析方法需要学习的知识太多，下面为大家简单的介绍色谱柱筛选的这一步。

1、HPLC色谱分离模式的选择

在建立化合物的HPLC方法时，可以首先根据化合物的分子量大小，极性大小及PKa，选择合适的分离模式，在适当的分离模式下去再去优化同类的色谱柱及流动相。化合物分子量<>

化合物分子量>2000Da时，可按图2来选择：

图2 分子量>2000Da的分离模式

2、反相键合相色谱柱性能影响因素在实际工作中所涉及的化合物绝大部分都可以使用反相色谱进行分离，下面先分析反相键合相色谱柱性能的影响因素，只有了解影响色谱柱性能的因素，才能结合目标分析物的性质、需要达到的分析效果及实验室条件来选择适合的色谱柱。

2.1 影响色谱柱性能的物理参数

(1) 硅胶纯度

硅胶纯度和残留金属离子浓度，硅胶的杂质会影响化合物的峰形，硅胶表面的金属含量高会影响碱性化合物的峰形，易发生拖尾。

(2) 色谱柱尺寸填料床的长度和内径，增加色谱柱长度，可以在一定程度上提高柱效，但也会升高压力和导致峰展宽；宽柱径，提高载样量，但也会增加横向扩散，同样会导致峰展宽。窄柱径可以节约溶剂，可减少横向扩散，但压力较大，对系统要求较高。

(3) 颗粒形状及粒径球形颗粒柱效高、重现性好、柱床结构均匀，不规则形柱床结构不均匀、流动相线速度不均匀，容易谱带展宽；平均颗粒直径，粒径越小，柱效越高，柱压也越高。粒径分布越广则柱效越低，压力越大。

(4) 颗粒表面积

颗粒外表面和内部孔表面的总和，以m2/g表示，相对而言高表面积对样品具有较强的保留能力，更大的柱容量和分离度。而低表面积能更快达到平衡状态，更适合梯度洗脱程序。

(5) 孔径

颗粒的孔或腔的平均尺寸，范围是80~300?，大孔径的填料颗粒可以延长大分子溶质在填料表面的滞留时间，改善分离，所以大孔径填料适合分离大分子化合物或者水动力体积较大的分子。

2.2 影响色谱柱性能的化学因素

(1) 键合类型及键合相

键合相分子与基体单点相连为单体键合，这种键合方式可以提高传质速率，缩短柱平衡时间，；聚合体键合为键合相分子与基体多点相连，这种键合方式可以增加色谱柱稳定性，增加载样量。而键合相不同会直接影响化合物的保留行为。

(2) 碳覆盖率

高碳覆盖率可以提高分辨率和重现性，但分析时间长。

(3) 封端

硅胶键合相填料中有部分未封端的残留硅羟基，如图封端可以减轻待测组分与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应，改善保留和峰行，这对于碱性化合物尤其重要。而不同的封端技术也会直接影响色谱柱的效能。

图3 硅胶键合相填料

3、反相键合相色谱柱的选择

3.1 重现国标文献中方法

选择色谱柱粒径、比表面积、基质表面特性、键合类型等相似的色谱柱，或者利用USP网站及一些色谱柱选择软件，如“column selector for acd/chemsketch”来查询相似系数，选择相似系数高的色谱柱。

3.2 建立新化合物分离分析方法的色谱柱选择

根据目标分析物的分子量大小、溶解性、Pka值，以及分离要求、仪器、成本等各方面来选择色谱柱。

(1) 根据分离目的选色谱柱，对映体分离常选择手性柱，离子化色谱可选择离子柱，蛋白多肽、DNA可选择凝胶柱或离子交换柱，一般的小分子化合物可选择普通反相柱，如C18、C8柱、苯基柱等等。

(2) 根据实际需求和设备选择填料粒径，普通HPLC一般选择5μm或3.5μm粒径的色谱柱，而UPLC则常使用1.7μm——3.5μm的色谱柱。

(3) 比表面积，高比表面积有助于分离，低比表面积更适合梯度洗脱程序。

(4) 孔径，大分子化合物适合大孔径，在保证比表面积的前提下，选择孔径大的。

(5) 键合相的选择

直链烷基键合相C18和C8适合中等极性化合物，对于极性化合物可以选用硅羟基未封端或特殊封端的C18柱，如Agela Technologies的Venusil ASB C18柱；或者键入极性基团的C18柱，如图4所示，waters的shield RP18柱就是这类；

图4 键合极性基团的C18键合相和传统C18键合相

还有一类是同时键合了烷基和阴、阳离子交换基团的C18柱，IMTAKT的Scherzo系列就是这类，这类同时Scherzo-SS-C18同时键合了C18、阳离子和阴离子交换基团，也很适合于分离两性化合物和弱极性化合物。例如厂家所给的应用谱图中对于神经递质的分析(图6)，神经递质在普通C18柱上保留和峰形都不太理想，Scherzo-SS-C18在不加离子对试剂的条件下就能达到很好的分离。

对于芳香环较多的化合物，苯基柱是最佳的选择，

HILIC，亲水作用色谱，可以作为反相色谱的补充。