实验专栏丨揭开慢病毒包装神秘面纱，让TA变得So Easy！

源自人类免疫缺陷 I 型病毒（HIV-1）的慢病毒载体（lentiviral vector）已成为哺乳动物细胞中基因传递的主要工具。慢病毒载体含有顺式作用元件 - 中央多聚嘌呤区（central polypurine tract，cPPT）使其不受细胞分裂的控制，允许广泛细胞类型的有效转导，包括静止细胞；且因其整合位点更安全，转基因负荷量更大（可容纳 6.5 kb 外源基因）及基因毒性更小等优势，在临床试验中，慢病毒载体比其他基因转导方法更常用。

最早的慢病毒载体是携带转基因的具有复制能力的病毒。为了使这些载体更安全，通过一系列修饰将 HIV 载体进化为将病毒包装和生产所需的序列与编码病毒蛋白的序列分开的形式。下面由中洪博元生物研发部袁总监为全方位解析慢病毒载体。

第1代慢病毒载体

慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

第一代基于 HIV-1 的慢病毒载体将载体组分分成三个质粒以增加安全性：包装质粒，编码病毒糖蛋白的 Env 质粒（包膜质粒）和转移质粒。

利用基因工程手段特异性删除包装质粒的包装信号或 LTRs 以减少载体制剂中 RCL（复制型感染性慢病毒）的产生。

第2代慢病毒载体

通过修饰系统中的辅助基因蛋白（Vif，Vpu，Vpr 和 Nef）开发了第二代载体。即删去第一代慢病毒载体包装质粒中 HIV 的所有附属基因，这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和转染能力，同时增加了载体的安全性。但目前尚不能确定这种载体是否能转染全部种类细胞。第3代慢病毒载体

第三代慢病毒载体系统由四个质粒组成。将包装载体分成两个质粒：一个编码 Rev，一个编码 Gag 和 Pol；去除了 tat 基因，代之以异源启动子序列；构建自身失活的慢病毒载体 ，即删除 U3 区的 3' LTR，使载体失去 HIV-1 的增强子 及启动子序列，这样的载体整合入目的细胞，即使存在所有病毒蛋白也不能转录出 RNA。因此，第三代慢病毒载体系统更加安全。

为什么要采用慢病毒？

1、调控基因表达过程中遇到的难题

2、质粒转染效率因目标细胞而异

3、较难获得稳定表达

4、难获得稳转细胞系

慢病毒系统的优势

1. 它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到稳定表达。

2. 在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，因此具有广阔的应用前景。

慢病毒与腺病毒系统比较

慢病毒包装流程

实验流程

实验注意事项及要点：

1、质粒浓度和纯度（无内毒素）

2、转染试剂的选择和转染条件优化

3、超速离心或浓缩试剂盒浓缩

4、不同比例稀释后转染293T

5、阳性克隆的选择

实验步骤：

Day 0 : set up 293T cells.

细胞密度控制在60%到80%覆盖度。太稀会影响滴度，太高后期细胞会死亡。

Day 1 : vector transduction：

四质粒系统转染 (各质粒比例和转染试剂的优化)

Day 2 : 48小时收集一次上清，保存于4 ℃。

Day 3：72小时收集上清，3,000 g 离心10分钟，取上清冻存于-80℃冰箱。

一般实验不需要测滴度，直接转染目的细胞后建系即可。

如果需要测试病毒滴度，一般采用梯度稀释法制备病毒悬液加入到预铺入96 孔板的细胞中，然后计算TCID50。

如何计算TCID50：

慢病毒转染和增强剂：

1.使用polybrene聚凝胺：主要通过中和细胞表面的唾液酸和病毒分子间的电荷排斥来增强病毒感染细胞的效率。

2.病毒孵育6小时后更换新鲜培养基。

慢病毒载体用于基因过表达

启动子：

1、一个载体表达三个功能性蛋白

目的蛋白

绿色荧光蛋白

嘌呤霉素抗性基因

2、检测方式和功能

qPCR、WB、免疫荧光

荧光显微镜

药物筛选获得稳转株

慢病毒载体用于基因过表达

慢病毒载体用于基因敲降

U6启动子启动 shRNA 的转录

shRNA形成二级结构，发挥RNA干扰功能

shRNA 参与的基因敲降

细胞自身合成 pri-miRNA （染色体）

外源基因合成shRNA （载体或病毒）

合成siRNA直接转染 （合成物）

慢病毒载体用于基因敲降