ra嗜碱性粒细胞白血病细胞模型RBL-2H3

ra basophil leukemia cells model RBL-2H3

概述

RBL-2H3是大鼠嗜碱细胞性白血病细胞,它是1978年由美国国立牙科研究所免疫实验室从 Wistar大鼠嗜碱性粒细胞中分离、克隆所得的亚系,是一种肿瘤细胞株,与大鼠腹腔肥大细胞(RPMC)相比, RBL-2H3细胞具有均一性好、活力高、可以无限传代、可操作性强、试验变异小等优点。RBL-2H3细胞在肥大细胞脱颗粒及相应的信号转导通路、肥大细胞稳定剂、FcεR理化性质与细胞骨架结构关系等多个研究领域具有广泛的应用。

RBL-2H3检测致敏原方法

RBL-2H3细胞检测物质致敏性在国外已经有相关的文献报道。 Hoffmann等研究发现,由单一特异性抗体被动致敏的RBL-2H3细胞几乎可以分析各种致敏原提取物,甚至包括非常罕见的致敏原。RBL-2H3细胞脱颗粒试验检出的致敏原与传统检测方法(包括IgE结合抑制试验、皮肤反应实验、抗原含量检测)的结果有很好一致性。利用转染人FcεRI受体亚单位的RBL-2H3细胞检测人致敏血清,既能检测到较低浓度的抗原,又能提供有关抗原生理活性的信息,其检测结果与鼠类模型和CAP抑制实验具较好的一致性,这是免疫化学法检测抗原所达不到的。此外,RBL-2H3细胞模型还可用于重组抗原的检测。RBL-2H3细胞建立致敏原体外检测模型主要有以下两个步骤

1.特异性抗体的制备

抗原只有与已结合在RBL-2H3细胞表面FcεRI上的特异性IgE结合导致FcεRI交联,脱颗粒反应才会发生,所以由人工致敏方法得到大鼠特异性抗血清是试验的关键部分。大鼠RBL-2H3细胞表面FcεRI具有种属特异性,故不能用人的抗血清替代大鼠抗血清。制备特异性抗血清时,若抗原为完全抗原,可以直接多次免疫大鼠,制得抗血清;若抗原为小分子半抗原,首先要将半抗原与蛋白结合,制成完全抗原。可以采用混合酸酐法、活泼酯法及碳二亚胺合成半抗原-BSA结合物,再通过SDS-PAGE等方法测定交联反应,紫外分光光度计法测定其交联比,双向免疫扩散法测定抗原特异性。然后用半抗原-BSA结合物和弗氏佐剂联合物,经多次免疫大鼠,制得抗血清。

2.致敏原激发

将制得的抗血清与RBL-2H3细胞共孵育,然后加入抗原进行激发,通过检测RBL-2H3细胞脱颗粒释放的炎性介质来判断被检物质的致敏性。

3.检测指标选取

肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化导致了3类生物学应答:

(1)肥大细胞经历调节性分泌,通过胞吐作用释放其颗粒内预合成介质,如组胺、β-己糖胺酶、5-HT等;(2)肥大细胞酶性合成脂类介质,如前列腺素、LTs和PAF等;(3)肥大细胞启动基因转录、翻译和细胞因子释放。根据RBL-2H3细胞活化脱颗粒的不同反应过程和相应生理变化,可以选择不同的检测指标,常见的有以下几种:组胺和β-己糖胺酶组胺和β-己糖胺酶:都是RBL-2H3细胞内预先合成的介质,储存在分泌颗粒中。当RBL-2H3细胞受到抗原激发或其他药物的直接刺激后可以直接释放,主要介导过敏反应的即刻相反应。组胺检测常用荧光分光光度法及酶免疫分析方法。β-己糖胺酶检测常采用加入酶底物显色的方法。

LTC4和PGD2:LTC4和PGD2是肥大细胞活化后新合成的脂类介质,主要介导急性过敏反应的迟缓相反应。PGD2与平滑肌细胞上的受体结合,能扩张血管和收缩支气管。LTC4不仅能长时间的引起支气管收缩,若注入皮內,还能产生红肿反应。ITC4和PGD2的检测主要釆用 ELISA法。

细胞因子检测:细胞因子在介导过敏反应的细胞免疫、体液免疫和过敏反应的调节中起重要作用。既可直接参与炎症反应,亦能募集中性粒细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞等多种炎性细胞至炎症局部。RBL-2H3细胞激活后能够持续地合成和释放多种细胞因子,通常选取IL-4和TNF-α作为检测的指标。有硏究表明,在致敏原激发后的2~4h,IL-4和TNF-α的含量高,且浓度保持稳定。细胞因子检测常用ELISA法。

优点与局限性

利用RBL-2H3细胞脱颗粒试验检测型过敏反应致敏原具有较好的可行性,与传统致敏性评价方法相比,RBL-2H3细胞模型具有以下优点:

(1)灵敏度高,专属性强,可以定量RBL-2H3细胞脱颗粒检测已经经过许多试验的验证,检测方法有较高的灵敏度,如荧光分光光度法测定组胺的检测限为pmol级,ELIAS法检测细胞因子的检测限为0.001ng,有较强的专属性。

(2)重现性好RBL-2H3细胞是大鼠肿瘤细胞株,具有无限增殖能力,细胞形态一致,反复试验结果较一致。而传统方法采用豚鼠和大鼠,个体差异较大,重现性较差。

(3)操作简单,适合大量药物的筛选RBL-2H3细胞脱颗粒试验为一种体外方法,所需的试验周期短,并且可以同时进行多个药物检测,适合大量药物的筛选,利于新药开发和中药等成分复杂药品的致敏性研究。

(4)减少整体动物的使用,节约人力、物力与传统方法不同,RBL-2H3细胞模型不仅减少了动物的使用量,利于动物保护,而且节省了人力、物力,减少了试验经费。

(5)适合过敏机制的研究,与体内实验相比,体外实验具有干扰因素较少,实验条件易控,可以人为改变培养条件即可观察细胞在单因素或多因素影响下的生理改变等优点,非常适合药物作用机制的研究。