原代大鼠脾T、B淋巴细胞提取、分选与培养

培养T、B淋巴细胞问题集锦（望好心的你指导指导！感激不尽）：

我自己的目的细胞是培养大鼠脾脏T、B细胞，希望它们能坚持1-2周，现在用的是淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque提取纯淋巴细胞群，一只大鼠脾脏提出来的纯淋巴细胞量比较少，3-4*10⁷个，未加刺激物，因为还没有分选，不出意外，第三天活细胞就大片大片死掉，现在想试试破红的方法，考虑到最后也要进行流式或磁珠分选，所以看看哪种方法得到的T、B细胞性价比高一点，同时兼顾量稍多，活性稍好的方法。现有以下几个问题。

1、制作淋巴细胞悬液：不采用淋巴细胞分离液的方法，如果用破红的方法，红细胞裂解液的裂解时间和加入量（3-4ml、3-4min?），需要预冷吗还是室温？破红结束需加终止液吗（如1ml完全培养基或含2%胎牛的PBS）还是直接离心取细胞就好？离心为1000r/5min、1500r/10min、1400r/7min,哪一种呢？

2、考虑到淋巴细胞周期非常短，那取出来后就立即上流式或磁珠分选T、B细胞？，若是上流式：则CD45圈门圈出淋巴细胞，然后CD3标记T细胞，CD20标记B细胞？若是用磁珠，那T、B细胞用的磁珠试剂盒是哪种呢，磁珠大小的选择？阴选还是阳选比较好？

3、得到T、B细胞后1ml培养基重悬，需要细胞调整浓度吗？有资料说细胞最好密一点生长，如10cm培养皿1×10⁸/ml，96孔板1×10⁶/ml? 取出来直接培养于10cm培养皿或T25培养瓶？或根据实验内容分选完后直接种96孔板、24孔板等，不需要适应性生长（还是因为它们周期短的缘故）？ 入培养器皿后需要长2小时后，重新吸出至新的培养皿或瓶吗？以达到去除巨噬细胞的目的（我个人认为不用，因为后面要分选T、B细胞）。

4、接入皿/瓶/板后，直接在板里加T、B细胞刺激物或者提前包被培养物品？若是直接加，多久加一次呢（3天）？

T细胞刺激物：anti-CD3及anti-CD28？均是（2ug/ml）?或者conA(5 ug/ml)？

B细胞刺激物：PMA及anti-CD40，各为（20 ng/ml）及（2.5μg/ml）?或大肠埃希菌的LPS（浓度不知）

若是包被板子，直接包被孵育2小时后，就用这个板子来培养细胞1-2周？中间还需要添加刺激物再刺激吗？

5、T细胞的培养体系：1640的基础培养基、1%双抗、10%血清、50uMβ-巯基乙醇、1mM 丙酮酸钠、10mM HEPES，是这个配方吗？需要加IL-2吗？因为本身也是T细胞的刺激因子，后期是要刺激T细胞的，这里加了不就是双重刺激？但我看有些文献是加了的。

B细胞培养体系（正在摸索）：1640的基础培养基、1%双抗、10%血清、50uMβ-巯基乙醇？

6、T、B细胞换液：半换液，不离心，直接枪头吸培养基上层？（我把吸出来的细胞放在小皿里看，淋巴细胞挺多的，我没有混匀培养基的，保持淋巴悬浮细胞自然沉淀，这样换液感觉细胞也有损失，但离心换液细胞损伤太大了，细胞禁不住，而且种板离心换液就很麻烦，所以还是选半换液？）

种板后首次换液在3天后？之后每3天换一次还是2天？

7、分选好的T、B淋巴细胞可以冻存吗？要用的时候再复苏再加刺激物？还是必须要即取即用？（1只大鼠脾脏取的淋巴细胞远远不够实验量，所以要积累着做，自己试过淋巴细胞群冻存再复苏，看着还行）

8、流式或磁珠分选后的T、B细胞还需要做鉴定吗？

望各位友友答疑解惑，不甚感激呀！！