蛋白质原核表达
生物体内的许多蛋白质的含量都非常少，为了获得大量的目的蛋白，我们可以通过基因工程技术将编码蛋白的核酸序列导入到某个宿主细胞，使其大量表达。这种将克隆化基因插入合适载体后导入宿主细胞用于表达大量蛋白质的方法一般称为蛋白质表达技术。蛋白质表达技术在蛋白质纯化、定位，蛋白质的结构域分析及蛋白质的体外功能分析等方面都有应用。
按照宿主细胞来划分，蛋白质表达系统可以分为原核表达系统和真核表达系统两大类。原核表达系统有大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统。真核表达系统有酵母菌表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物细胞表达系统。根据目的蛋白质的情况选择合适的表达系统。
常用的表达系统主要是大肠杆菌表达系统和哺乳动物表达系统。
与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强、更易于生长和控制、实验技术相对简单、成本廉价、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具有各种特性的质粒可供选择等优点。所以对于一个全新的基因，如果没有任何文献资料，那么首先考虑的应该是大肠杆菌表达。
表达流程
原核表达载体的构建→转化到高效表达的宿主菌→目的蛋白的诱导表达→细菌的扩大培养→制备细菌蛋白粗提物→目的蛋白质的纯化。
原核表达的一般程序
1. 原核表达载体的构建
表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体，是外源基因在大肠杆菌中表达所不可缺少的重要工具。原核表达载体通常为质粒，表达载体除具有克隆载体所具有的性质以外，还应具有表达元件（转录和翻译所必须的DNA序列）。
启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列，其大小在20~300bp之间，具有转录目标基因mRNA的功能，是基因表达不可缺少的重要元件。原核生物的启动子通常具有一些高度保守的核苷酸序列，如-10区、-35区等。-10区一般位于转录起始点上有10bp左右，一般由6~8bp组成，富含AT，又称为Pribonw box；-35区位于转录起始点上游35bp处，一般由10bp组成。一般认为，大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子，-35区与RNA聚合酶σ亚基结合，-35区与RNA聚合酶的核心酶结合。-10区、-35区这些保守序列的碱基变化会影响RNA聚合酶的识别和结合，从而影响转录水平的高低，同时-35区和-10区的距离，以及-10区与转录起始核苷酸的距离都会影响转录水平的高低，所以启动子有分为强启动子和弱启动子。由于RNA聚合酶和启动子结合的过程中还涉及其他蛋白因子的作用，所以启动子又可以分为组成型和调控型。在达成杆菌表达系统中，大部分表达载体采用调控型启动子控制目的基因的表达。
核糖体结合位点是指紧靠启动子下游、从转录起始点开始延伸十几个bp长度的一段序列，翻译起始密码子ATG通常位于它的中心位置。SD序列与起始密码子之间的距离是影响mRNA转译成蛋白质的重要因素之一。另外某些蛋白与SD序列结合也会影响翻译过程。
终止子具有终止转录的功能，在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点下游插入一段很强的rrnB核糖体RNA转录终止子。
大肠杆菌表达载体要求：①有一个强的启动子及其两侧的调控序列；②应有SD序列，且SD序列与起始密码子ATG之间要有合适的距离；③在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游应加入不依赖ρ因子的转录终止区。
构建好表达载体之后，提取重组载体的质粒，然后用质粒进行表达宿主菌的转化。
2. 目的蛋白的诱导表达
IPTG是常用的诱导剂，可诱导目的DNA的表达。诱导原理如下：首先，E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、渗透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
3. 目的蛋白的检测
目的蛋白表达可以通过考马斯亮蓝染色或免疫印迹的方法进行检测。考马斯亮蓝R-250是一种氨基三苯甲烷染料，可以非特异性地与蛋白质进行结合；免疫印迹的方法是通过抗原抗体特异性反应，来进行目的蛋白表达的检测。
