蛋白质磷酸化修饰

DNA转录成mRNA要再翻译成具有特定氨基酸序列的蛋白质才能在体内发挥功能，其中大部分蛋白质往往还需要经过化学修饰才能具备真正的活性，这种修饰称为翻译后修饰（PTM）。翻译修饰的过程，就是在蛋白质氨基酸序列中添加特定氨基酸或改变特定化学官能团的过程，进而改变蛋白质的结构。已有实验证明有三百多种潜在的PTM类型，并且同一个蛋白质可能在多个位点发生修饰，这就促成了蛋白结构和功能上的多样性。

在众多的PTM类型中，磷酸化修饰（Phosphorylation modification）的蛋白占到了所有蛋白质约三分之一，是最普遍的修饰类型之一。会影响到细胞内信号转导、细胞结构、细胞增殖、凋亡、转录、代谢过程以及调控病原微生物的适应能力等等，所以在不同细胞中，蛋白磷酸化水平会呈现不同的差异，特定位点的磷酸化程度可能从小于1%到大于90%。

磷酸化的过程就是在激酶的催化作用下，将ATP的磷酸根基团，转移到蛋白的氨基酸侧链上，ATP随之变为ADP。对于大部分蛋白质来说，磷酸化修饰是一种可逆的短暂性修饰，当某一蛋白的某一位点帮助蛋白完成了任务，蛋白质又会在磷酸酶的作用下发生去磷酸化，就像蛋白质功能的“开关”，少数磷酸化是永久性的修饰。

磷酸化修饰可以发生在多种氨基酸残基上，可分为四大类：

1.丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸羟基残基上的O-磷酸化；

2.组氨酸、赖氨酸残基上的N-磷酸化；

3.半胱氨酸残基上的S-磷酸化；

4.天冬氨酸、谷氨酸残基上的Acyl-磷酸化；

在真核细胞中，以丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和酪氨酸（Y）残基的磷酸化修饰为主，三种氨基酸的磷酸化在同一个细胞中相对丰度比例约为pS:pT:pY= 1800:200:1

常见磷酸化蛋白鉴定方法

Western-blot

原理：利用SDS-PAGE凝胶电泳分离出的蛋白质，从PAGE胶转移到固相载体上，以一抗为探针，结合有标记的二抗，再用显色剂显影。根据抗原-抗体特异性结合的特性，只有被磷酸化修饰的蛋白才会在相应分子质量的地方出现条带。

特点：一般实验条件均可实现，特异性强、分辨率高，但只能做半定量，现多用来验证质谱结果。

缺点：由于特异性磷酸化抗体制备难度大，难以鉴定新位点，不易检测到蛋白多个磷酸化位点。

同位素标记

原理：以放射性同位素³²P标记的磷酸盐作为磷酸基团供体, 在激酶催化下,将带有³²P标记的磷酸基团转移到底物蛋白上，再通过凝胶电泳分离，用放射性自显影检测磷酸化蛋白质。

特点：能检测蛋白磷酸化位点和单个蛋白磷酸化。

缺点：放射性强，有一定危险性。

Phos-tag^TM SDS-PAGE

原理：Phos-tag^TM是一种包含了Zn²⁺或Mn²⁺的功能性分子，能与磷酸离子特异性结合，形成稳定的化合物。在常规SDS-PAGE胶中加入Phos-tag^TM，降低迁移速度，从而分离出磷酸化与非磷酸化蛋白。

特点：不受抗体限制，可用于所有磷酸化蛋白检测。另外，Phos-tag^TM还可以用到Western Blot和质谱中，作为纯化的方式。

缺点：精度不够，更多用来分离，用于western-blot和质谱检测。

质谱

原理：质谱仪可将分析样品电离为带电离子，这些离子在电场或磁场作用下在空间或时间上发生分离，检测器检测后得到质荷比（m/z）与相对强度的质谱图，再据此推算出分析物中分子的质量，可同时利用质谱图对分析的物质做定性分析，根据离子强度做定量分析。由于具有磷酸化修饰的多肽相较于无磷酸化修饰的多肽多出79.9663Da的分子量，可通过其他碎片离子信号推测序列级磷酸化修饰位点。

特点：高通量、可同时获得成千上万的蛋白定性及定量信息，可确定同一蛋白多个磷酸化修饰位点与水平。

缺点：技术难度高，需要依赖平台与质谱分析知识。