【讨论】大肠杆菌Red基因敲除
发布于 2020-12-30 · 浏览 1798 · IP 北京北京
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最近一直在使用这套系统对BL21(DE3)进行敲除，电转后双抗筛选，板子上长出的菌落经菌落PCR（引物距离目的基因300bp左右，避开了同源臂）鉴定后，出现两条带，根据大小可以看出，一条是野生型，另一条是抗生素替换的大小。很奇怪，按理说，大肠是原核生物，没有等位基因，不会存在单交换的现象，那么是因为什么呢？
难道是因为菌落不均一？我电转后涂板子是100ul涂得，菌量应该没有很大，应该不会存在野生型污染吧。
更奇怪的是，我在将者这种杂合的菌落转入无抗培养基中，42℃摇过夜，再进行PCR，就都变成野生型了。
用的是pKD46，抗性片段的模板是pKD13（卡那抗性），胶回收完了之后用DpnI 37℃处理了1h，然后又胶回收用的，浓度在150ng/ul左右，转了10ul。
目前打算是现在卡那的培养基中37℃摇过夜，再进行PCR鉴定。看看是不是还这样
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 1798
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