【原创】图文详解WB和qPCR中,内参如何校正上样误差

我们在做WB和实时荧光定量PCR时，不可能回避的一个问题就是内参。可能有人在想，为什么需要引入内参呢？如果不引入内参会怎么样？好吧，既然有此问，我就好好地回答一下这个问题。

我们先看一看下面的图1。为了便于理解，我们从真实的实验中抽象出一个极简的模式，即实验组只有1个细胞，而对照组只有2个细胞。我们的本意当然是希望实验组和对照组的细胞数量一样多，但很不幸的是，总有那么多的实验操作会导致误差，误差多到根本无法人为控制，总之，一句话就是，最后实验组取到1个细胞，对照组2个。从图中，我们可以看到，实验组细胞表达了两个目的基因产物（既可以是mRNA，也可以是蛋白质），而对照组基因表达情况与实验组是完全一致的，即两者之间不存在差异。假如我们不引入内参，我们会非常自然地得出一个结论，实验组表达了2个基因产物，对照组表达了4个基因产物，对照组高于实验组，这肯定是有问题的。

现在我们来看一下图2。实验组细胞表达了3个目的基因产物，对照组细胞表达了2个目的基因产物。很显然，实验处理导致细胞基因表达量升高了。但是，由于上样误差，实验组取到了一个细胞，对照组却取到了2个细胞。最后，我们直观地认为，实验组表达了3个基因产物，而对照组表达了4个基因产物，对照组基因表达量高于实验组。看一看，因为没有引入内参，我们竟然可以得出与事实完全相反的结论。尽管这也是一个有差异的结论，但却不符合客观事实。

可能就有人问，不引入内参，有没有可能得到符合事实的结论呢？也是有的。如图3所示。实验组跟对照组取的细胞数量完全一致，都是1个细胞，我们看到实验组细胞表达了3个基因产物，而对照组只表达了2个基因产物。我们由此得出结论，实验组表达量高于对照组，实验处理导致基因表达增强。这个结论是符合事实的。但不得不说的是，实验组跟对照组取的细胞数量完全一致，这种事件发生的概率可能比买彩票中500万的概率都低。我们可以认为，在一次真实的实验过程中，它根本就不会发生。

针对图1、图2以及图3中存在的问题，我们就有必要引入内参。首先说一说什么叫做内参？简单地说，内参就是一个参照，它可以将两个很难直接进行比较的对象，变得易于比较。比如，有两个正数A和C很难直接进行比较。这时，我们可以引入一个正数B，它跟A和C都有一定关联。A是B的2倍,C是B的3倍。通过B，我们间接地知道，A小于C。这里的B就好比我们做实时荧光定量PCR和WB时所选择的内参。

其次，我们需要注意到一个问题，我们做实时荧光定量PCR和WB时，最后比较表达差异，我们称其为“半定量分析”，既然是半定量，它跟绝对定量当然是有区分的。绝对定量不仅仅有数值，还应该有单位。但我们做实时荧光定量PCR和WB时，得到的只是基因的相对表达量，准确地说，是目的基因相对于内参基因的表达量，相当于目的基因的绝对表达量与内参基因绝对表达量的比值，所谓的半定量就是这个意思。这个概念应该不难理解，如果觉得费解，大家可以想一想相对原子质量是怎么来的，这其间的道理是一样的。

好了，到此基本概念已经说清楚了，我们现在给图1、图2 以及图3引入内参。看一看结果会发生什么样的变化。

先看图1。图1中实验组细胞目的基因表达量与内参基因表达量的比值等于2比1，最终结果是2。对照组细胞目的基因表达量与内参基因表达量的比值等于4比2，最终结果也是2。结论是实验组跟对照组基因表达没有差异。这与没有引入内参的情况是不一样的。通过引入内参，我们得到了符合事实的结论。

再看图2。用与图1同样的计算方法，我们得出实验组目的基因相对表达量为3，而对照组目的基因相对表达量为2，实验组高于对照组。显然与没有引入内参的情况完全不同。

接下来，我们看一看图3。我们惊奇地发现，引入内参跟没有引入内参的结论居然是一致的。但我们需要知道，这只是一种理想的状态。我们更常看到的只是图1和图2所示的情况。

相信到目前为止，大家已经充分认识到内参基因的强大功能了。

所以，在实时荧光定量PCR和WB中，内参究竟是怎么校正上样误差的呢？通过上面的讲解，大家应该看得非常明白了。我再小结一下，可以这么讲，上样误差导致了实验组跟对照组细胞数量的不一致，更多的上样量，意味着更多的目的基因，同时也意味着更多的内参基因，当我们选择用目的基因与内参基因作比时，就会发现，更多上样量导致的这种误差竟然被内参轻易地抵消了。最后，实验组和对照组目的基因的表达量有没有差异，只与各自基因本身的表达量有关，而与所取到的细胞数量关系不大，如前所述，你取到1个细胞会有1个内参基因产物，你取到2个细胞就会有2个内参基因产物，你取到再多的细胞也会被内参平衡下来，这就是内参校正上样误差的本质。

最后，想说一个非常重要的问题。那就是内参的选择问题。网上有很多地方讲内参选择的问题，其实，内参选择无外乎六个字，那就是“准确性”和“稳定性”。所谓准确性，就是这个内参可以拿来作参照。你检测的是胞浆蛋白的表达，那就选择胞浆内参，检测的是核蛋白的表达，那就应该选择核内参。所谓稳定性，就是你施加实验因素处理后，不会显著影响这个内参基因的表达，如果这个内参基因的表达跟目的基因一样，也受影响了，再选择它作内参，就会有问题。如图4所示。施加实验处理之后，这个内参的表达量也升高了。如果我们此时还选择它作为内参，就会得出这样的结论，实验组目的基因相对表达量为3比2，等于1.5，对照组目的基因的相对表达量为2比1，等于2，实验处理导致了目的基因表达量降低。而现实的情况是，目的基因的表达量升高了，从2个变成了3个，而非降低。为什么会这样呢？因为我们选择了一个不合适的内参，或者说我们选择了一个对实验处理不稳定的内参。