h9c2的细胞凋亡检测

主要是实验原理，检测过程比较详略~~祝大家实验顺顺顺，丽丽丽

一、细胞凋亡过程（受到一些外部或内部因素刺激，此时，细胞群还有能力自救）

1、在细胞为了维持内环境的稳定，发生凋亡（遇到因素刺激，细胞决定自杀以保存实力）

2、细胞内部会先启动凋亡层级反应，caspase层级反应（由细胞核开会决定，下发各细胞器最后的晚宴分工），

3、细胞线粒体功能减退，表面发生皱缩，细胞膜内陷包裹各个细胞器形成凋亡小体，最后被其他细胞清除或吸收（细胞牺牲小我，维持大我——组织细胞群）

二、检测原理：Annexin-V与细胞磷脂双分子层上的磷酯酰丝氨酸特异性结合，PI染料可以与细胞核结合，两种染料所携带的荧光基团可以激活并检测。

1、正常细胞的磷酯酰丝氨酸是在磷脂双分子层内层的，Annexin-V 无法结合，会在试验中洗脱掉。

2、当早期凋亡发生时，磷酯酰丝氨酸会发生外翻，与Annexin-V 结合，可以激发其携带的荧光基团并检测。

3、凋亡进行到晚期，细胞膜破裂，外加PI染料，与细胞核发生结合，荧光基团激活并检测（坏死细胞也会发生该反应）。

三、实验分组并进行染色

1、空白组 ——无染色 ——使用正常组细胞

2、Annexin-V组——仅染色Annexin-V ——使用模型组细胞

3、PI组 ——仅染色PI ——使用模型组细胞

4、实验组 ——染色Annexin-V+PI ——对照组，阳性组，模型组，给药组...。

染色步骤根据每个厂家的试剂盒不同而异，这里不再详述啦~

四、检测收集数据

我是使用流式细胞仪检测的，所以这里仅分析流式细胞仪的检测结果。

1、细胞群确认，画“门”：调整仪器为测试模式，调节SSC与FSC电压，在合适的范围内圈图，同一种类的细胞一般分布在同一位置，将细胞粒子调整到图的左下方，以下图为例，大概占整图的面积1/3左右。

（当时作为小白的我，第一次成功做出图来，左下角是新手的礼物——细胞碎片，一般实验中多加注意，离心力和洗涤次数会减少细胞碎片的）这里附加一个细胞碎片的识别方法：无论你怎么调节SSC与FSC的电压，粒子总会在那里一动不动，它们就是细胞碎片了。

2、观察空白组，是否携带自发荧光。调整仪器为检测模式，取10000粒子数计数，观察FITC与PI通道是否有激发光。

3、检测单阳组，调整合适荧光电压。

一般我是看直方图调整电压的，如下图，阴性细胞群在接近原点的位置（左），阳性细胞群信号号全部收到检测限以内，并可以明显区分激发细胞群信号和阴性细胞群信号。两侧都预留的有一定距离（右侧较多，预留可能的强信号）

4、收取所有组数据。

5、进行补偿调节(自己画的简图，完美~）。可以检测前调整，也可以实验结束后调整。

Annexin-V 组会发出单色荧光，呈现单通道阳性，细胞分布图如下左，将阳性细胞调整到Q1门中，并大概与Q3门同一对称轴，将该补偿粘贴至PI组，之后再同理调节PI组，如下图右。之后将PI组的补偿复制粘贴到实验组中。

五、数据分析

以下图为例（机智如我，我又画了一个图防止数据泄露~）：

Q1门——是单信号Annexin-V FITC阳性，PI阴性。也就是说凋亡发生在早期，磷酯酰丝氨酸外翻，但细胞膜还是完整的。

Q2门——是双信号阳性，凋亡晚期或者坏死细胞群，细胞膜破裂。

Q3门——是双信号阴性，细胞膜完整，磷酯酰丝氨酸没有暴露，说明是个好的细胞群。

Q4门——是单信号PI阳性，一般是由于实验过程中受到机械损伤导致的，通过优化实验条件，可以减少甚至消除该区结合率。我在正式实验中很少遇到。

六：奇怪的数据总结：

1，正常组有细胞凋亡，怎么优化实验条件也无法消除，这是怎么了？

所有的细胞都是在生长进行中的，或者在实验中会不可避免会发生一些损伤，所以会导致我们实验中检测曾正常组，会有1%左右的细胞发生凋亡，这个是正常的实验误差。百分百阳性的实验，我目前为止没有做出来过（我会用我嫉妒的小心心去怀疑它~~）

2、只有PI信号，没有Annexin-V 信号。

1. 这个。。。我也遇到过，但后期排查，因为把染料加错了。但也有可能是染料的问题，如果是新开的试剂，就再做一次，一般BD超保2个月的试剂都还是可以用的（哈哈，保存的比较好）。
2. 以前用的一款BD分析仪器，机器配置了不同型号的细胞滤器，直径太大的细胞直接过滤掉了，需要排查一下细胞直径和滤器是否吻合。
3. 排查是不是没有圈到正确的细胞群。调节SSC与FSC电压，如果又出现一群细胞，好吧，是把目标细胞搞漏了。
4. 排查是否是阳性信号没有检测到，调节FITC电压，观察直方图，看是否是由于发射光信号没有接收到。
5. 也有可能是操作的问题！！！心情太激动，把细胞全部搞碎掉了。我看到有人用10000g离心细胞，心都在滴血。一般实验室的细胞1000~3000g就可以了，不要离心太长时间3~10min。

3、上次的实验条件，这次一模一样，但是无法重复。

昨天的我已经不是现在的我了，现在的我也不是现在的我了，细胞也一样，最好用种类明确，代次清晰，没有分化的细胞做实验，有条件的用15代以内的细胞。每次实验微调一下实验条件，做批次内对比，不要做批次间对比。

4、细胞群散点图在一条斜线上，调节电压无法区分。

好的，细胞已经死了，不用纠结了。

5、细胞只有Q2门双阳。

可能是刺激条件太敏感，细胞发生了晚期凋亡。此时数据也还是可以用的，细胞明确发生了凋亡，如果想看早期凋亡，可以调整刺激时间。

6、正常组细胞群与模型组细胞群，分布位置不同。

模型组细胞已经受过刺激，形态可能发生了变化，在模型组中的正常细胞，可能会发生位置变化，甚至与阳性组细胞群交叉，尽量通过调节SSC与FSC电压，将正常细胞压至散点图Q1门的左下方，再调节PI和FITC通道电压，拉开直方图中的信号图。同时通过分析直方图来分析实验结果，散点图作为参考。

7、出现两个正常细胞群。

可能细胞发生了分化，导致细胞敏感度不同。也可能是刺激不均匀导致。

。。。

欢迎大家一起来总结奇葩的数据~

祝大家实验顺利啊~小白最终都会变成老白的~

有一段时间做细胞凋亡，吃住都在实验室，仪器坏了（走廊里有人跳着走，把激光震歪了），小白还傻傻不知道，鼓捣到了一整夜，吓的不行，怎么都重复不出来，想想当时真是傻傻的，也真诚的。纪念一下。