影响因子4+的ceRNA+实验验证思路分享

大家好，今天和大家分享的是2020年8月发表在Cancer Cell International (IF: 4.175)上的一篇文章。文章构建了ceRNA网络，并且进行了实验验证，赶紧一起来看看吧~

研究背景

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最具侵袭性、致命性的脑部肿瘤，且经手术、化疗、放疗等治疗手段后，患者中位生存时间仅有8-15个月，预后极差。因此，发现并研究GBM肿瘤标志物和治疗靶点是十分迫切的。

材料

①GEO数据库的GSE51146、GSE65626、GSE4290数据集，TCGA数据库的TCGA-GBM队列测序数据和相应临床数据。

②手术中切除并立即放入-80℃冷冻的GBM组织标本和非癌组织标本。

③正常人胶质细胞系（HEB）和人GBM细胞系（U87MG, U251），37℃ 5%CO2 10%(v/v)胎牛血清（FBS）。

研究方法

①利用在线工具GEO2R进行差异分析

②加权基因共表达网络分析（WGCNA）

③构建ceRNA网络

④基因功能富集分析

⑤冷冻组织和细胞系的RT-qPCR

⑥Western blot

⑦mimics转染

⑧荧光素酶报告实验

⑨敲减lncRNA

补充图1 构建ceRNA网络的工作流程图

研究的方法还是挺丰富的，接下来看看结果如何吧。

结果1：差异RNA的筛选

首先用GEO2R对GSE51146队列进行差异分析，按FoldChange＞2和FDR＜0.05过滤，获得差异mRNA和lncRNA表达谱。结果显示在GBM中1531个基因上调、1882个基因下调（图1a, b）。按同样的方法分析GSE65626队列获得差异miRNA表达谱，152个miRNA上调、153个下调（图1c, d）。

图1 GBM中差异mRNA、lncRNA和miRNA的火山图和热图

结果2：lncRNA和mRNA的共表达分析

由于lncRNA可与miRNA的靶mRNA竞争，所以关注lncRNA和mRNA表达的正相关关系。WGCNA包分析GSE51146队列中lncRNA和mRNA的共表达情况。相关系数(R)和显著性(P)热图显示，共表达的粉色模块相关系数R=0.92（P=0.0001, 图2），该模块的lncRNA和mRNA在GBM中表达显著相关。

图2 WGCNA构建GBM中lncRNA和mRNA的共表达关系

结果3：构建GBM中的ceRNA网络

上一部分得到的粉色模块中构建lncRNA和mRNA的共表达网络（图3a），并计算所有基因的节点度RP11-268F1.3、RP11-547C13.1、lncRNA-GPC4、RP11-90M5.4, RP11-339N8.1、RP4-764D2.1和 GS1-466O4.2这7个节点度大于100的lncRNA用于构建ceRNA网络。

lncRNA相互作用的miRNA通过使用DIANA-LncBase v2.0来预测；然后使用miRWalk 3.0来识别与上述miRNA的靶向mRNA。将7个lncRNA和这些有互作关系的mRNA、miRNA整合，构建ceRNA网络（图3b）。

图3 粉色模块的共表达网络以及ceRNA网络

结果4：ceRNA网络中mRNA的GO和KEGG富集分析

通过对ceRNA网络中mRNA进行GO和KEGG富集分析。如图4，这些mRNA显著富集于先天免疫应答、细胞分化等BP项，以及原发性免疫应答缺陷和Ras信号通路。

（通过GO、KEGG富集，揭示这些mRNA与癌症的发生发展密切相关，是常用的基因功能注释方法，大家要学会哦~）

图4 ceRNA网络中mRNA的功能富集分析

结果5：对候选的mRNA进行验证

利用TCGA-GBM对ceRNA网络中的mRNA进行差异表达验证，结果显示GBM中C1s和HSD3B7的表达显著上调，同时与患者的总生存相关（图5a, c）；这两个mRNA的表达上调在GSE4290队列，U87MG、U251细胞系和冷冻的GBM标本的RT-qPCR中也得到了验证（图5b, d, e）。Western blot的结果也显示C1s和HSD3B7蛋白在GBM组织中表达上调（补充图3）。这些结果都表明C1s和HSD3B7可能成为GBM诊断的生物标志。

图5 验证ceRNA网络中的C1s和HSD3B7在GBM组织过表达 

补充图3 Western blot检测C1s和HSD3B7蛋白在GBM组织中的表达

结果6：miRNA过表达细胞中C1s和HSD3B7的表达检测

根据ceRNA网络，miR-132-3p、miR-346、miR-584-3p和miR-874-3p可能靶向C1s，miR-132-3p、miR-346、miR-381-3p和miR-584-3p可能靶向HSD3B7。因此通过转染miRNA模拟物的方法，构建miRNA过表达的U251细胞。与未转染细胞对照，RT-PCR结果显示miR-132-3p、miR-346、miR-584-3p和miR-874-3p过表达细胞中，C1s的表达均显著下调（补充图4A）；HSD3B7的差异表达具有异质性（补充图4B）。

结果7：验证lncRNA与靶向C1s的miRNA之间互作关系

将lncRNA RP11-268F1.3、RP11-547C13.1和RP11-90M5.4克隆到psiCHECK2 载体构建荧光素酶报告体并与miRNA模拟物共转染U251细胞。转染了miR-132-3p，miR-346和miR-874-3p模拟物细胞的荧光素酶报告活性显著降低（补充图4C, D）。

通过RNA干扰的方法分别构造敲减lncRNA RP11-268F1.3、RP11-547C13.1和RP11-90M5.4的U251细胞。RT-PCR结果显示，与未敲减细胞相比C1s表达均显著下调（补充图4E）。

总的来说，以上结果表明lncRNA RP11-268F1.3、RP11-547C13.1和RP11-90M5.4在GBM中通过与相应的靶miRNA结合发挥ceRNA的作用，最终调控靶点C1s。

总结

这篇文章的研究方法可以说是很丰富，但思路是很简单的：差异分析，构建ceRNA网络，各方面验证。ceRNA网络中lncRNA与mRNA竞争相同的miRNA，故两者的表达是具有正相关关系的，所以WGCNA构建lncRNA-mRNA共表达是筛选lncRNA一种可行的方法，有需要的同学可以学习起来。在实验验证部分，本文通过RT-qPCR、Western blot验证了GBM中可能的重要靶标C1s。不止于此，文章还挖掘了C1s的上游分子机制，通过构建miRNA过表达细胞的方法，确定了靶向调控C1s的miRNA；加上敲减lncRNA来验证lncRNA与这些miRNA之间的靶向关系，从而验证了ceRNA网络里的成分。如此丰富严谨的研究设计，是不是也给你的课题提供了新想法呢？生信+实验验证也是目前的一大趋势，这样可以让结论的说服力更强，经费足够的条件下可以借鉴学习起来哦~

补充图4 ceRNA网络的实验验证