载体构建，一直连不上去
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我的载体9000bp最近在做片段与载体连接，一直连接不上，敬请各位指教：
目的基因约9000bp，是从ppR9TT载体切下来的，用的是NEB公司的XbaI 和KpnIHf双酶切，这两个酶的最适Buffer都是cutsmart.载体酶切会产生3000bp 6000bp片段，6000片段通过胶回收，浓度15ng/uL左右，载体是可以确定切开的。片段不确定，但一般这两个酶在我们实验室挺常用。
连接酶用了TakaRa公司目的基因与载体的摩尔比为10：1左右，的T4连接酶的反应条件为16度过夜
感受态为自制的大肠杆菌MRF，筛选的平板为载体的amp加chl抗性。
实验结果只有空载体转化组有菌落生长，重组载体无菌落生长。做了几次，重新酶切，连接，制感受态，还是连不上去
敬请指教
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 3032
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