变性高效液相色谱分析

denaturing high performance liquid chrmatography

概述

变性高效液相色谱分析( DHPLC),又叫温度调节的杂合双链分析(TMHA),是利用在部分变性条件下同源、异源双链特征的差异进行变异检测。另外,在非变性条件或完全变性条件下, DHPLC还可用于分离、分析单链核酸片段。这一技术最先由 Oefner于1995年建立,现已有公司生产出商业化的检测仪器。目前全球使用最多也最易操作的是美国 Tansgenomic公司开发的wAVE核苷酸片段分析系统,它通过一个独特的DNA色谱柱 DNASep柱进行核酸片段的分离和分析。

原理

DHPLC技术的原理是基于未解链的和部分解链的双链DNA在部分失活条件下具有不同保留的性质。这种部分失活条件可以采取升高温度的手段获得。所有基因组DNA的单拷贝均可通过PCR反应大量扩增,杂合子个体的DNA经扩增产生异源双链,由于错配位点的氢键被破坏,因此在异源双链上形成鼓泡,导致它与纯合子个体的DNA扩增产物(完全匹配的同源双链)的解链特征不同。在部分加热变形条件下,异源双链DNA分子更易于解链形成Y型结构,与固定相的结合能力降低。当流动相中乙腈浓度梯度增大时,异源双链将先于同源双链被洗脱岀来,带有突变序列的样本呈现岀异源双链和同源双链混合物的峰形特点,而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰值。据此可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段,从而提供有无突变信息是一种快速、高效、准确、经济并可半自动化地进行基因突变及多态性检测的技术。

应用

目前,该技术在基因突变检测、DNA微卫星鉴定、肿瘤杂合性缺失的检测、RT-PCR的竞争性定量、基因作图、细菌鉴定、DNA片段大小测定及寡核苷酸的分析和纯化等许多基因组研究领域中应用广泛,最近已被进一步应用到mRNA的检测,鉴定差异表达的基因。

优势

DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优。与传统的SSCP、DGGE等方法相比, DHPLO有较多的优点。SSCP的结果受血样质量、提取方法等因素的影响,并且需要跑胶、电泳;DGGE则需要标记引物,存在放射性污染,这两种方法都比较费时费力。而 DHPLO则高度自动化,可以自动取样,检测每个样品只需要8分钟左右。 DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于,它能够纯化DNA片断。当然,只能检测杂合突变是 DHPLO的不足之处,但是这可以利用混合的方法(即将纯合突变样品和野生型样品混合)来解决。