收藏贴：从差异到表型，如何确认生信分析时肿瘤中高表达的分子？

在分享的百篇生信论文中，用到Oncomine平台数据的文章达到50%以上。那么，Oncomine数据平台终止服务之后，生信分析论文应该如何做呢？至今仍有很多盆友在问我Oncomine没法注册了怎么办？可以确定的是，Oncomine平台不再接纳新的注册！但是生信分析和数据科学将在科学研究中扮演越来越重要的角色。而且随着测序技术的推广和应用，公共数据库雨后春笋般地涌现（如GEPIA、UALCAN和TIMER等）。我们仍然可以借助公共数据来发表论文，这是大势所趋。

今天，我们再来谈谈差异表达。关于基因差异表达和存活率之间的关系。总结来说，在肿瘤中高表达的分子更适合做生信分析。首先，高表达相对于低表达更容易被检测到；其次，在讨论分析过程中，我们更容易清晰地表述。因此，肿瘤中高表达，预后更差或更好的基因，最适合用来做生信分析。

差异表达与生存分析是文章中最重要的部分。也就是差异表达要有用，基因表达差异能引起表型差异，这是最为关键的科学问题。

1. 情况一，与正常组织相比，A基因在肿瘤中高表达，但是A基因高表达和低表达组患者的存活率没有差异，说明A基因与肿瘤的发生、发展基本没有关系。
2. 情况二，与正常组织相比，A基因在肿瘤表达无明显变化，但是A基因高表达和低表达组患者的存活率有差异，说明A基因可能参与肿瘤的发生、发展，但是不具备预后和诊断价值。
3. 情况三，与正常组织相比，A基因在肿瘤中明显高表达；同时，A基因高表达和低表达组患者的存活率有差异，这说明A基因可能在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，具备预后和诊断价值。但是，这种价值是潜在的，不确定的。需要进一步Loss-of-function和Gain-of-function做验证，体内、体外实验分别说明。

下面这段话，我们已经分享很多次。

对于医生，个人建议是学会R语言！这样在繁重的临床工作之余，可以挖掘数据库，不做实验就能发论文，而且科研和临床思维混搭，既能接临床的地气，又能接科研的仙气。最重要的是阅读过的文献和做过的生信分析，可以进一步促进对临床上疾病的认识，提升医生的诊治水平。医生跟专门做基础研究的人当然是比不过，但是医生的临床思维也是生物研究人员难以得到的。从时间上来算，一个临床和科研兼备的医生成长周期本就要比专职做科研的生物科研人员长。

其实，抓住基因表达差异和表型（存活率）差异的分析，文章就已经成型了。分子机制的探究，是升华。然而，现在纯生信论文基本无法发表了。因此，我们必须掌握差异表达相关的实验操作。在实验室做实验，我们最熟悉的操作，一个是PCR，一个是Western blot，而这实际上代表了检测差异的最基本策略，转录和蛋白水平的差异检测。若论这种策略的理论基础，我想就是中心法则吧。

一般情况下，研究目标是蛋白，单是蛋白的调节，就涉及非常多的生化过程，基因组甲基化、转录及其调控（如lncRNA、miRNA和cirRNA）、翻译和翻译后修饰（如磷酸化/去磷酸化、泛素化）。而在疾病过程中，上述任一环节的改变都会通过级联放大反应导致最功能执行者——蛋白水平的变化。蛋白变化是结果，而这个结果的原因既可以是蛋白自身调控的变化，也可能是基因组或转录水平的变化导致的。因此，检测基因表达差异时，起码要检测兴趣基因的mRNA和protein，所以要用到我们前已述及的PCR和Western blot。

一、差异表达，一切差异皆可检

正如我们在生信分析的总结中所说，差异表达是研究的起点，也是研究的难点。虽然万事开头难，但是千里之行始于足下，检测差异表达是第一步。下面我们结合文献，一起感受下，如何检测差异表达。检测差异表达分为入门（细胞）、进阶（动物）和高阶（测序）三个段位。

入门级别

差异表达的结果一般放在Figure1，入门级别是从细胞水平入手的。检测方法包括qRT-PCR、Western blot、免疫组化（包括免疫荧光），生信分析可辅助证明。

文章来自TMEM9 promotes intestinal tumorigenesis through vacuolar-ATPase-activated Wnt/β-catenin signalling (Figure1)。该图证明TMEM9在结肠癌中高表达，图b是oncomine数据的总结，显示TMEM9在乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和粘液瘤中高表达 (in silicon)；图c通过qRT-PCR和Western blot证明TMEM9在结肠癌细胞系中高表达 (in vitro)；图d是在小鼠结肠癌肿瘤组织(in vivo)进一步证明。

图e通过免疫组化在结肠癌患者标本中检测TMEM9的高表达 (clinical specimen)。生信、细胞、动物和临床样本四个角度，从转录和翻译水平证明TMEM9在结肠癌中高表达，思路明确，方法多样，值得学习！

文章来自FGL2 promotes tumor progression in the CNS by suppressing CD103 + dendritic cell differentiation (Figure1)。图a和b用Western blot检测胶质瘤细胞系、PBMC中FGL2的表达。

图c用流式细胞术检测新诊断胶质瘤患者肿瘤中FGL2的表达。

图d用免疫组化检测新诊断胶质瘤患者肿瘤中FGL2的表达。该论文更侧重临床标本的检测，是从Western blot、流式细胞术和免疫组化的方法学角度对差异表达进行检测。逻辑清晰，也是很好的套路。

进阶级别

进阶级别是从动物模型入手的。检测方法也是qRT-PCR、Western blot、免疫组化（包括免疫荧光），生信分析可辅助证明。

文章来自TOX promotes the exhaustion of antitumor CD8 + T cells by preventing PD1 degradation in hepatocellular carcinoma。图A是流式细胞术检测肿瘤浸润淋巴细胞中PD-1、TIM3等maker的表达。

图B是肿瘤浸润淋巴组织的单细胞测序结果，属于高阶。图C是对临床标本的肿瘤浸润淋巴细胞做进一步流式检测，分析CD8+T细胞不同耗竭状态的比例。

图D是肝癌小鼠模型中肿瘤浸润淋巴细胞耗竭状态的检测，方法是流式细胞术。

图E是另一种肝癌模型，自发诱导性肝癌模型。肿瘤浸润淋巴细胞耗竭状态的检测，方法仍然是流式细胞术。

补充图Figure1中图A和图B是生信分析结果。图A是韦恩图对多个数据库的检测结果取交集；图B是对耗竭性CD8+T细胞中的TOX进行对比分析，箱型图。

本文流式分析是主要方法，既没有qRT-PCR，也没有Western blot；标本类型主要是临床标本和动物肿瘤组织。从临床标本到动物模型的思路，逐步递进。

高阶级别

高阶级别是从方法学上讲的，也就是进行测序。特点就是贵！

该图来自TOX reinforces the phenotype and longevity of exhausted T cells in chronic viral infection。图A是小鼠肿瘤组织进行流式检测；图B是测序分析, Tox locus-specific bisulfite sequencing of P14 T cells from mice infected with Armstrong, gp33-low or wild-type clone 13 for 8 weeks；图C是临床标本进行流式检测。

该图来自TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8 + T cell exhaustion。图a和图b是多维分析和GO分析不同组别中差异表达的基因。

图c是热图展示差异表达的基因，图d是热图展示染色质调控相关的基因，图e是对图d的可视化视图展示；图f显示RNA质谱分析的结果。

高阶差异表达的好处是个性化、数据多，上档次。但是，不足更明显，死贵死贵！！方法重要，但不是最重要的，小米加步枪干得过飞机加坦克。神器不神，关键在人。qRT-PCR和western blot的结果一样可以出现在CNS期刊的论文中，水刊中也有单细胞测序的结果。