PCR入门难？分子生物博士教你快速逆袭（附PCR技术学习资源）

一、qRT-PCR概念

qRT-PCR即将RNA逆转录为cDNA后作为模板进行实时荧光PCR分析，用于检测最初RNA的表达量

二、qRT-PCR原理

原理A：左手染料，右手探针！

通过染料或探针的荧光表征DNA来统计DNA量，荧光易检测，可定量，光强与DNA量正相关。

原理B：说好的荧光值呢，怎么又变成Ct值了？

数学换算找规律，只有模板变Ct！依据PCR中DNA指数增长的规律计算初始模板量！

三、qRT-PCR流程

1.原理复杂如斯，实验不得难如上青天？

四大步”，走完qRT-PCR完整实验流程！实验原理中复杂部分均能自动化操作，有仪器、软件或试剂支持，操作极为简便！

2.RNA提取

注意：1、为了防止RNA的降解，整个qRT-PCR过程都需要严格控制RNA酶的污染。2、琼脂糖电泳/分光验证RNA质量：
 电泳呈现3条带，分别是5S,18S和28S rRNA的条带，其中28S rRNA条带亮度是18S rRNA两倍。分光A260/280≈2（1.8到2.0之间）

3.反转录

反转录过程体系，以TaKaRa为例：

4.qRT-PCR反应阶段

注意：1.模板量与CT值负相关，未知浓度样品稀释后应从最高浓度做起。2.模板应先行适度稀释，再加入反应体系中，提高扩增效率。3.引物浓度过高或者引物二聚体均会引起熔解曲线出现杂峰。4.必须设置阴阳对照

5.结果分析——熔解曲线

熔解曲线验证扩增产物特异性，单一产物熔解曲线峰图重叠呈单峰（同一产物解链温度相同），若出现双峰说明产物不特异，可能存在引物二聚体或非特异性扩增，则引物可能存在问题。

6.结果分析——扩增曲线、

数据有效性标准：1.曲线平滑2.起始无扩增3.起峰时间正常4.NTC和NRC无扩增或扩增起峰较晚NCT：No Template ControlNRT：No RT Control

Ct值是判断实验成功与否的重要参考Ct值得可信范围：临床研究：小于33；科学研究：小于38；内参基因：小于20，样品间差距不超过1

7.结果分析——数据处理（△△Ct法）

1、内参基因均一化样本差异

Ct目的基因 -  Ct内参基因 =△Ct

2、其他和对照样本比较

△Ct处理样本 - △Ct对照样本 =△△Ct

3、使用公式计算

倍数变化 = 2-△△Ct

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