免疫荧光双标求指教！！

各位老师，我做的小鼠颈动脉斑块的免疫荧光双标，标记的是巨噬细胞，m1cd68＋inos m2cd68＋cd206.我cd68一抗是大鼠抗小鼠，2抗是山羊抗大鼠红色。 cd206inos一抗是兔抗小鼠 2抗是山羊抗兔。用的是abcam的抗体。我查的是cd68cd206是膜蛋白，可是片子上好像就没有。染的一片，老师们能给我分析一下吗？谢谢啦！！！

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步骤是，1.新鲜组织取材，一个小时内直接冰冻切片，

2.切片丙酮固定十分钟，放4度冰箱。

3.第二天做免疫荧光，pbs洗2次每次3分钟

4.血清封闭37度半个个小时

5.pbs洗2次3分钟

6.加一抗孵育37度1小时

7pbs洗2次3分钟

8加二抗30分钟孵育

9pbs 洗2次3分钟

10加dapi室温10分钟

11甘油封片。

12，2个小时后读片。