干货总结：PCR 技术/经验大盘点

最后编辑于 2019-05-13 · IP 浙江浙江

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PCR 技术盘点

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性，模板DNA与引物的退火(复性)，引物的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

反向PCR （inverse-PCR）

反向PCR（inverse-PCR）是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多，而Inverse-PCR一般只要有特异条带，基本上就是目的片段。

直接原位PCR

原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。

间接原位PCR（原位杂交PCR）

与直接原位PCR所不同的是，靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入，而是标记一段与扩增片段互补的探针，在扩增结束后，应用此探针进行原位杂交。因此，此处主要介绍原位杂交，其余方法同原位PCR。

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

实时荧光定量PCR（realtime PCR）

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

重叠延伸PCR

重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR，简称SOEPCR）由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。

甲基化PCR

甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific PCR，MSPCR），其作用原理基于DNA经亚硫酸氢钠处理后，来自父方非甲基化序列的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而来自母方甲基化序列则保持不变，随后用具有高度特异性的引物进行扩增。

降落PCR

降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。

差示反转录PCR实验

差示反转录PCR也称为mRNA差异显示技术，它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品，该方法自问世以来被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。

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