细胞爬片免疫荧光双标实验操作流程

1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min。

2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）。

4. 血清封闭：PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清（前提是二抗来源是山羊），室温封闭30min。

5. 加一抗：吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。

6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min。

注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。  

7. 血清封闭：吸水纸吸干液体，在玻片上滴加正常山羊血清（前提是二抗来源是山羊），室温封闭30min。

8. 加一抗：吸水纸吸掉封闭液，不洗，然后滴加稀释好的一抗，加完一抗后于4°C湿盒中避光孵育过夜。（注意：第二种一抗的种属与第一种一抗的种属要来源不同才可以，如小鼠和兔）

9. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min。（注意：若检测第一种抗体选用的是红色荧光，则第二种必须得选择其他颜色的荧光）

10.复染核：滴加 DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。

11.用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。