PCR副孔间时不时来个溶解曲线双峰

前3列蓝色的是内参GAPDH，中间3列绿色的是内参β-actin,后三列是我检测的目的基因

上面标小黄旗显示的结果都是 溶解曲线双峰（绿色最下面那排显示2 的那个孔是溶解曲线双峰+高标准差，其他2个孔标1的是高标准差，当时加样的时候加到最后一个孔，发现混合物不够了，所以出现高标标准差也是预想中的事），我看了下溶解曲线和其他2个副孔类似，有一个在65℃附近的小高峰，就是很奇怪，大部分孔都没事，怎么会有偶尔几个孔出现溶解曲线双峰，这种情况该如何避免，求高手指教。还有就是出现的溶解曲线双峰的CT值貌似和副孔间差距不大，是否可以不剔除掉，直接使用。

上图是右侧3个孔的溶解曲线，第1个孔没有标小黄旗，后2孔出现小黄旗。我看了下溶解曲线，感觉没啥区别啊，咋就出现小黄旗了咧？

再看这个溶解曲线，是右侧2个孔的溶解曲线，左孔标2的小黄旗显示溶解曲线高峰，但是在图中是峰稍低的那条线，峰高的那条线反而是右侧孔标1的，没有显示溶解曲线双峰。这是咋回事？

再看这个溶解曲线，为右侧9个孔的溶解曲线，3个标小黄旗的被机器识别：双溶解曲线，但是我看了下左侧的溶解曲线，也没看出有啥区别啊

求高手指教哈，赠送叮当。求好人指点迷津