分享小鼠BMDM培养心得（个人经验，欢迎指正和讨论）

因为在论坛里求助和发表过关于小鼠巨噬细胞之类的帖子，有战友问过我BMDM培养，我把我自己的心得体会和详细步骤贴上来，希望能给初学者帮助，也欢迎大家的指正～

最重要的经验就是，要参考别人的，但是不能墨守成规，要灵活机动～

1.器械：若干灭菌眼科剪、眼科弯镊、一次性细菌培养皿（买最便宜的，或者自备灭菌玻璃皿也可）、高糖DMEM（Hyclone或者Gibco）、灭菌PBS、FBS（澳胎Gibco，分装后提前1天取出一管放入4度冰箱）、双抗（Gibco，同FBS，提前一天取出）、集落刺激因子MCSF（peprotech，配置浓度为10ng/mL）还有些细胞培养皿离心管之类，我的是买的corning

2. 购买SPF级别4周龄C57小鼠，我买的是雄鼠，脱颈处死后浸泡于装有75%酒精的烧杯内，约5分钟。用眼科剪在脚踝处环形切开，剪断跟腱，分离出胫骨末端。向上剪开至大腿根部，摸到髋关节，分离出大转子。尽可能快速和利落的分开股骨和胫骨，并去除肌肉、筋膜，完成粗分离，浸泡于装有5%双抗的PBS的培养皿中，合上盖子，置于冰上。此步骤切记不可以剪断股骨、胫骨任何部位，一旦骨髓暴露，应丢弃不用。

3. 转移至超净台，此时超净台里应有充足的冲洗针5mL注射器、灭菌培养皿、配置好的含1%双抗的高糖DMEM、含1%和3%双抗的PBS、培养瓶、离心管等。在含有3%双抗PBS的培养皿内细分离骨头，基本去净骨膜。转移至1%双抗PBS培养皿中浸泡，并吸取充足含1%双抗的DMEM，剪开干骺端，冲洗骨髓腔，冲入新的培养皿中。此处理论上要冲洗骨骺，但是操作不当很容易污染，我只冲洗了骨髓腔，比较浪费就是了。

4.收集冲洗出来的培养基悬液，1000rpm 5min离心，丢弃上清液，换含20%FBS、1%双抗、10ng/mL MCSF的高糖DMEM重悬，5%CO2 37度培养。我是2-3只小鼠的腿骨放在1个T25培养瓶，此处可以细胞计数也可以不计，因为存在很多杂细胞。

5.培养原代要耐心，尽量少动它们，第三天不洗直接换液，第5天换液，第7天视作为成熟BMDM。我并没有购买溶解红细胞的试剂之类，反正它们不会贴壁，会被冲走的。

6. 使用F4/80抗体流式或者荧光检测。

更新：

我已经改用l929上清液啦（30%过滤后l929上清液，20%血清，1%双抗，余DMEM）

在骨髓细胞冲到细胞皿，重悬后加1-3ml红细胞裂解液，等比例加入中和培养基，重悬后去上清，换最终用的培养基，过细胞筛，可以培养咯！

感觉经济实惠，还在摸索……