经验分享｜细胞增殖分析（CCK-8 法）

研究 CCK-8 有一段时间了，积累了一些经验，今天就把完整实验 protocol 分享给大家～

一、材料

【材料】细胞悬液

【试剂】 CCK8

【仪器，耗材】96 孔板，二氧化碳培养箱，酶标仪

二、步骤

1、取对数生长期的细胞制备细胞悬液，细胞计数；

2、根据合适的铺板细胞数接种到 96 孔板中，每孔约 200 ul（2×10³-2×10⁴/孔）细胞悬液，同样的样本可做 3-5 个重复，将 96 孔板在 37℃、5%CO2 培养箱中培养 24,48,72 h；

3、设置空白对照组：不加细胞只加培养液的空白对照，其他试验步骤保持一致。细胞接种后贴壁大约需要培养4-8小时；

4、加入20ul CCK8：由于每孔加入CCK8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK8 的培养基，以换液的形式加入；

5、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）；

6、测定 450 nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长 450-490 nm，参比波长600-650 nm。

三、注意事项

1、当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用。避免边缘效应。   

2、用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板。

3、细胞种板数不易过多，否则细胞自身发生接触抑制，影响OD数值，较长培养时间建议每孔加入200 μl培养基。                  

4.若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。         

5、悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

6、加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。

四、常见问题

Q：96 孔板最边缘的细胞吸光值都较大？

A：这是边缘效应导致的，长时间培养过程中，一般边缘的孔中培养基挥发较多，培养基中各成分相对浓缩，细胞生长会更快，不能正确反映真实的细胞生长速度，所以需要弃用周围一圈孔板，加入培养基或 PBS。

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