分享我们的Protocol：慢病毒、逆转录病毒【浓缩】及【滴度测定】

【说在前面】
1. 木有鼠标（在充电）的时候打字排版很累，免费分享经验需要肯定和支持~
2. 这是我们自己的protocol，确认work的~
3. 做广告的各种试剂商就别来瞎说了，我用的确定不是你们家的试剂！不要误导别人。
4. 图片版权归me所有，请勿用于商业用途，否则告上法庭所要赔偿！

【试剂】
lentix293t细胞（clontech），dmem(hyclone)，fbs（hyclone北美）,质粒plv-shrna-greenpuro(或者redpuro、greenhygro、redhygro等慢病毒主载体)，pspax2、pmd2.g两辅助质粒，0.45um水系滤膜（millipore）,10cm皿（nest or corning）, powertrans293转染试剂，powervirus concentrator 病毒浓缩液，双抗（thermo）

【病毒包装】
1. lentix293t密度达到80-85%时准备转染，转染前换新鲜的dmem+10%fbs（无双抗），每个10cm皿大概7ml培液；
2. 按powertrans293说明书配转染复合物，每个10cm皿预计转20ug质粒（主载体：pspax2：pmd2.g=4:3:1），复合物配好后静置15min，逐滴加入到皿中，加好之后皿在平台上画十字，横向5次纵向5次，后放入培养箱中（画5次十字），此时刻记为0h，后文时间都是从此时刻计算；
3. 如果怕污染，就在6h-12h换液为新鲜的dmem+10%fbs（有双抗），有信心不会污染的可以不换液（我们用的转染试剂没啥毒性，所以可以不换液）；
4. 48h时，第一次收集上清置于4度保存，后小心轻柔的加新鲜配液8ml（有没有双抗随意，推荐有），72h再次收取上清，与第一次收的混合；
5. 4000g离心10min去除细胞碎片，上清过0.45um滤膜后收集至新的管子中。

以上，得到病毒原液！分装留取200ul-1ml样用于测定原液滴度，其余或者进行浓缩，或者分装后冻-80℃备用。慢病毒与逆转录病毒不要反复冻融。

【病毒浓缩】
1. 5盘10cm皿的细胞产毒，共计收两次，得到80ml的上述病毒原液；
2. 每40ml原液装入一个50ml的管子里，加10ml 5x的powervirus concentrator 病毒浓缩液，颠倒混匀后置于4度冰箱；
3. 每15min颠倒混匀一次，且确保管子一直置于4度（低温很重要），1h后就不用再管它了，让它自己4度过夜就行；
4. 4000g水平转离心20min，可见非常少量的白色沉淀（如果原液比较少的话，沉淀可能几乎不可见），小心吸弃上清，用下游实验的培养基（如dmem+10%fbs+双抗）重悬沉淀，即可得到浓缩后的病毒。

以上，得到浓缩的病毒液。我们一般每管用200-400ul重悬（对应40ml原液），重悬后不一定是澄清透明的，浓度高的时候是悬浊液，这样也没问题的，可以分装了冻-80度，额外分装一管5ul的。浓缩液的好处是不需要超离，也不需要太长时间的人为干预（v.s.超滤浓缩到疯）。

【滴度测定】
无论是原液，或是浓缩液，均可按以下方式测滴度
1. hek293t、hek293、hek293a、lentix293t等hek来源的细胞均可，种24孔板，用时需70-80%密度；
2. 病毒5ul，加800ul dmem+10%fbs+双抗+polybrene，混匀，取400ul给a1孔换液；
3. 剩下400ul，取80ul到新ep管里加720ul dmem+10%fbs+双抗+polybrene，混匀，取400ul给a2孔换液；
4. 剩下400ul，取80ul到新ep管里加720ul dmem+10%fbs+双抗+polybrene，混匀，取400ul给a3孔换液；
5. 剩下400ul，取80ul到新ep管里加720ul dmem+10%fbs+双抗+polybrene，混匀，取400ul给a4孔换液；
6. 每次加完一个孔都轻柔的画十字，直至所有的都加完之后，放到培养箱中画十字，此时记为0h时刻，静置6h；
7. 换液为400ul dmem+3%fbs+双抗，如果48h时培液很黄则继续换液为400ul dmem+3%fbs+双抗；
7. 72h看荧光显微镜，每个孔随机取3-5个视野拍照，用于计算滴度。
8. 下图是我们做的，测滴度的荧光图，很具有代表性↓

以上，得到了计算滴度的数据。下面说滴度该怎么计算，请与我的思维做好同步。。
先看图，从左到右再从上到下看，分别是“加了稀释了10的4次、3次、2次、1次、0次幂”的“2.5ul浓缩病毒”，另外给了个原液的图。
我们一般会根据原液和浓缩病毒（0次幂）这两幅来初步判断病毒是否包的好以及浓缩效果大致如何。
如果24孔板1个孔加了200ul原液都没多少亮的，那就别玩了，重包吧。理论上应该100%亮。
我们40ml浓缩到200-400ul，大概是浓缩100倍左右，除去损耗和其他潜在的问题，我加2.5ul浓缩病毒应该和200ul左右病毒原液亮度差不多，这样说明浓缩成功。
然后，我们看，随着稀释倍数的逐渐增加，感染上（被点亮）的细胞数和亮度明显减少。关键的来了，取这样的孔来计算滴度：感染效率看起来大概1%-5%左右的！效率太高的（>10%）不一定一个亮的细胞对应一个病毒（可能多个病毒攻击了一个细胞），效率太低的（<1%）你选的视野可能不具有代表性（有的视野有好几颗亮的，有的视野完全没有）。

估算该孔含有的病毒颗粒数x=（3-5个视野内亮点的平均个数）*（24孔板与视野直径比的平方）
估算浓缩病毒的滴度y= x*稀释倍数*（1000ul/加进去的原始浓缩病毒体积）

比如，上图中，第二个图我看亮的密度大概在1-5%之间，所以用这个来算滴度。图里大概有30个左右亮点，就算几个视野的平均亮点个数为30个好了。。
然后，我用的10x物镜看的，恰好眼睛下面看，6个视野直径=24孔板直径，也就是说，面积比应该是1:36；
那么这个孔里含有的病毒颗粒数=30*36=1e3个；
然后，这个孔是2.5ul的浓缩病毒被稀释了10的3次幂，那么，原本的2.5ul浓缩液就应该有1e6这么多颗粒数；
最后，换算成1ml的颗粒数，（1000ul/2.5ul=400）,那么，滴度应该为4e8。

我们最近做的，用这套系统最好的，5皿细胞收2次产了大概7e9的病毒。其中需要注意的是，数荧光个数的时候，太接近的亮点只能算一个，因为感染后养72h的时候细胞在分裂；很暗的亮点不要忽略，要计算进去。

以上。有什么问题可以站短我。。。