［求助］HindⅢ和PstⅠ两个酶分别单酶切均可成功，但是双酶切和分步酶切都失败了!
各位大神，本人在Takara公司购买HindⅢ，及PstⅠ两个限制性性内切酶（具体如图1，图2所示），拟行登革热病毒T载体质粒DNA（DV-T）双酶切实验，DV-T质粒DNA测序结果如图3 所示，图中蓝色字体标明的是相应的内切酶，根据说明选用适当的buffer（如图4所示），按道理应得到DV的230+bp目的片段，
但经多次反复实验均未能双酶切成功，经验证发现HindⅢ和PstⅠ两个酶分别单酶切均可成功，但是双酶切和分步酶切都失败了!是因为二者缓冲液的影响吗？还是质粒浓度过低，切出的200+bp片段未见条带呢？请问应该如何验证和解决?
具体情况详述如下：
图1
图2
图3：DV-T 质粒DNA测序结果
图4：缓冲液活性
根据贵公司提供的试剂说明，选用M buffer加入两种内切酶配成50ul体系，37℃2h孵育进行双酶切，2%琼脂糖凝胶电泳（100bp marker）未见条带200+bp条带：
后又用20ul体系尝试，结果同上；
于是考虑分步酶切，遂用M buffer及HindⅢ加入未酶切的DV-T质粒，37℃孵育2h，1%琼脂糖凝胶电泳（1泳道为1000bp marker），2、3泳道为HindⅢ单酶切后DV-T，4泳道为未酶切的DV-T质粒；可推测单酶切成功：
在其单酶切产物中直接加入H buffer及PstⅠ，37℃孵育2h，2%琼脂糖凝胶电泳（100bp marker）未见条带200+bp条带，1%琼脂糖凝胶电泳（1000bp marker）仍见3000bp条带：
于是用同样的方法验证PstⅠ，用H buffer及PstⅠ加入未酶切的DV-T质粒，37℃孵育2h，1%琼脂糖凝胶电泳（1泳道为1000bp marker），2、3泳道为PstⅠ单酶切后DV-T，4泳道为未酶切的DV-T质粒；可见PstⅠ单酶切也成功：
于是决定用割胶回收的方式分步酶切，考虑到割胶回收会有一定的损失，遂用两支50ul体系先进行PstⅠ单酶切，割胶回收后将回收产物合为一支以保障目的片段的浓度。
两支50ul体系先进行PstⅠ单酶切，1%琼脂糖凝胶电泳（1000bp marker）可见3000bp条带：
将全部割胶回收产物（已用PstⅠ单酶切）进行HindⅢ 单酶切，2%琼脂糖凝胶电泳（100bp marker）未见200bp条带：
请问为什么hind3和Pst1两个酶分别单酶切均可成功，但是双酶切和分步酶切(割胶回收)都失败了呢？是因为二者缓冲液的影响吗？还是质粒浓度过低，切出的200+bp片段未见条带呢？请问应该如何验证和解决？
谢谢各位的解答和建议
