求助免疫荧光对照组有信号实验组反而没有的问题
各位战友求教：
我最近做免疫组化，预期的蛋白使染核的，但是无论如何做不出来，反而对照的IgG组很容易就产生信号。
下图是预期蛋白的图片，无信号。
下图是对照组IgG，相同参数有核信号。
本人免疫组化步骤如下：
1. 组织固定：组织解剖后经4%多聚甲醛（PFA，用PBS溶液配制）固定 4度过夜或者室温2-3 h.（用2ml的小管）
2. 组织清洗：1 x PBS洗涤固定后的组织，共3次，5 min/次，除去多余的PFA。
3. 1%的TritonX-100/PBS(300-500μL)，37度消化20 min, 以促进抗原表位暴露 (可选步骤)。
4. 封闭：5% BSA (或山羊血清1：500，用1% Triton-X100/PBS配制)，室温封闭30 min- 1 h.
5. 加一抗：根据抗体效价用1% BSA（1% Triton-X100/PBS配制）将抗体稀释到特定浓度（1：100），室温孵育30 min，然后4度过夜（3d）。
6. 清洗一抗：清洗前可继续在室温孵育一抗30min, 然后用1% Triton-X100/PBS 清洗组织，4 X 15 min.
7. 加二抗：1% BSA（1% Triton-X100/PBS配制）将二抗1：1000稀释，与组织孵育4度过夜。
8. 清洗二抗：清洗前可继续在室温孵育30min, 然后用1% Triton-X100/PBS 清洗组织，4 X 15 min (若后续染核，可将次数减少).
9. 细胞核染色：Hoechst (1：500用1% Triton-X100/PBS配制) ，室温孵育20 min.(可不染，可选步骤)
10. 清洗组织：1% Triton-X100/PBS， 4 X 15 min.
希望各位大佬赐教
